外泌體在皮膚衰老中的作用及轉(zhuǎn)化應(yīng)用進(jìn)展

戴雨薇 王培光 楊森

[摘要]細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）是由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，外泌體是EVs的一個(gè)亞群，內(nèi)含RNA、DNA及多種蛋白，近年來發(fā)現(xiàn)與皮膚衰老相關(guān)。干細(xì)胞外泌體能夠減少皮膚細(xì)胞所受的輻射損害，維護(hù)皮膚屏障，且極有可能幫助恢復(fù)皮膚干細(xì)胞活力，而衰老細(xì)胞外泌體則損壞皮膚屏障結(jié)構(gòu)，傳遞衰老信號誘導(dǎo)周圍細(xì)胞衰老。目前干細(xì)胞外泌體轉(zhuǎn)化應(yīng)用的研究已取得了一定進(jìn)展，但實(shí)際臨床應(yīng)用仍阻礙重重。

[關(guān)鍵詞]外泌體;皮膚;衰老;細(xì)胞外囊泡;干細(xì)胞

[中圖分類號]R339.38? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）01-0184-03

The Role of Exosomes in Skin Aging and its Transformation Application Progress

DAI Yu-wei，WANG Pei-guang，YANG Sen

（Department of Dermatovenerology，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract： Extracellular vesicles （EVs） are bilayer membrane vesicles secreted by cells. Exosomes are a subgroup of EVs containing RNA， DNA and a variety of proteins. Stem cell exosomes can reduce the radiation damage to skin cells， maintain the skin barrier， and most likely help restore the vitality of skin stem cells， while senescent exosomes can damage the skin barrier structure and transmit senescence signals to induce the senescence of surrounding cells. At present， the research on the application of stem cell exosome transformation has made some progress， but the practical clinical application still faces many obstacles.

Key words： exosomes;skin;senescence;extracellular vesicles;stem cells

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）是細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)小泡，在各種細(xì)胞及組織之間起著物質(zhì)傳遞、信息溝通的作用，其各亞群主要以直徑大小區(qū)分。外泌體（約20～200nm）是EVs中的一個(gè)亞群，包含了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及RNA等物質(zhì)：蛋白質(zhì)主要包括骨架蛋白、膜相關(guān)連蛋白、四分子交聯(lián)體家族的CD9、CD63，MHC類分子及熱休克蛋白和脂質(zhì)相關(guān)蛋白。脂質(zhì)主要包括神經(jīng)酰胺，膽固醇、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂，多糖主要是甘露糖。RNA主要包括了mRNA、miRNA和ncRNA等。不同的外泌體在成分上有細(xì)微的差別，體現(xiàn)了細(xì)胞對外泌體形成控制的精密[1]。外泌體可被絕大多數(shù)細(xì)胞分泌或胞吞，且存在于幾乎所有體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊液、羊水、腹水、汗液以及月經(jīng)血。

目前，大家對外泌體的認(rèn)識主要是干細(xì)胞來源的外泌體在對心血管、肝臟以及神經(jīng)等多器官、系統(tǒng)的再生修復(fù)方面[2]，這顯示了干細(xì)胞來源外泌體在抗衰老方面的潛力。同時(shí)，又有研究表明[3]，衰老成纖維細(xì)胞（HDFs）表達(dá)的外泌體增加了4倍，而HDFs分泌彈力蛋白、膠原蛋白等物質(zhì)，在維持皮膚的彈性及水分中發(fā)揮重要作用—這提示了衰老細(xì)胞來源的外泌體在皮膚衰老過程中可能的作用。

本文將不同來源的外泌體與皮膚衰老的關(guān)系做一綜述，并將通過外泌體的轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究來展望其在皮膚老化治療中的潛力。目前，由于外泌體鑒定技術(shù)的限制以及定義直徑尚未統(tǒng)一，部分文獻(xiàn)仍以EVs通稱，但其實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證的功能與其他文獻(xiàn)中外泌體功能有重合，現(xiàn)綜述如下。

1? 干細(xì)胞外泌體對衰老的調(diào)節(jié)

有研究用人類多能干細(xì)胞外泌體（IPSCS-EXO）分別來處理UVB照射后及體外傳代30代以上的HDFs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPSCS-EXO在正常條件下可以促進(jìn)兩種HDFs的增殖和遷移，提高兩者I型膠原的表達(dá);并顯著降低后者衰老相關(guān)-半乳糖苷酶（SA-BETA-GAL）和金屬蛋白酶（MMP-1/3）的表達(dá)水平，而SA-BETA-GAL的高表達(dá)一直是自然衰老的標(biāo)志，MMP也是細(xì)胞衰老過程中高表達(dá)的重要酶物質(zhì)。IPSCS-EXO預(yù)處理結(jié)果則是抑制UVB輻照引起的損傷和MMP-1/3過表達(dá)[4]。另一項(xiàng)研究與其結(jié)果相似，互相印證：人脂肪源性干細(xì)胞EVs不僅增強(qiáng)了UVB輻照后HDFs的遷移能力，還可顯著抑制UVB照射誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的過表達(dá)，增強(qiáng)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅴ型膠原及彈性蛋白的表達(dá)。在其預(yù)處理的HDFs中，UVB照射后組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-beta1的表達(dá)顯著增加，而這兩種物質(zhì)是參與MMP抑制和細(xì)胞外基質(zhì)合成的重要因子[5]。以上兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)了干細(xì)胞外泌體改善光老化的積極作用。

此外，在人類脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（ASC-EXOSOMES）與特應(yīng)性皮炎（AD）的研究中，外泌體還被發(fā)現(xiàn)可以通過皮下注射的形式刺激神經(jīng)酰胺的合成[6]。神經(jīng)酰胺是增加皮膚角質(zhì)層水合度，維持皮膚屏障、抗衰老及美白等方面的重要物質(zhì)，也是如今抗衰老的熱門成分。

皮膚組織存在少量的成體干細(xì)胞—具有多向分化潛能，是維持皮膚年輕態(tài)的儲(chǔ)備力量[7]，其衰竭是皮膚衰老的重要原因之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高度純化的IPSCS-EXO用于培養(yǎng)活性氧（ROS）水平升高的衰老間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）時(shí)，MSCs的ROS水平可降低，衰老表型減輕。因此，來自人類干細(xì)胞的外泌體可以緩解干細(xì)胞在培養(yǎng)中的老化[8]。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞EVs在體外能顯著恢復(fù)衰老的MSCs活力[9]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以從一定程度上預(yù)示干細(xì)胞外泌體對衰老皮膚成體干細(xì)胞的積極作用。

2? 衰老細(xì)胞外泌體對衰老的影響

MiR-23a-3p過表達(dá)會(huì)使HDFs透明質(zhì)酸（HA）分泌減少，衰老相關(guān)標(biāo)志物上調(diào)，增殖受抑[10]。國外有學(xué)者在2D細(xì)胞培養(yǎng)和人體皮膚等效物中，發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p還可以外泌體形式從真皮衰老HDFs分泌，繼而作用到表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，而后者在其不間斷刺激下分化受阻[11]。角質(zhì)層的分化不完全直接導(dǎo)致皮膚屏障的損傷，皮膚脆弱易衰老。

另一個(gè)研究在發(fā)現(xiàn)衰老HDFs來源EVs對角質(zhì)形成細(xì)胞分化及屏障功能維持的消極作用同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了其促炎因子IL-6水平的升高[12]。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明外泌體是細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型 （SASP）中的一種，SASP可誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞中DNA損傷反應(yīng)（DDR）激活和SASP的產(chǎn)生，從而在局部和最終在全身水平上創(chuàng)造炎癥環(huán)境[13]。炎癥環(huán)境可能會(huì)加速炎癥性衰老，這是一種慢性、全身性，與年齡相關(guān)的炎癥狀態(tài)，并易于發(fā)展成與年齡相關(guān)的疾病（ARDs）[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)了DNA受損細(xì)胞分泌的EVs會(huì)影響端粒的調(diào)節(jié)[15]，而端粒變化已被公認(rèn)與細(xì)胞衰老相關(guān)。

除此之外，衰老黑素細(xì)胞來源的外泌體也被發(fā)現(xiàn)參與了皮膚細(xì)胞衰老，有人發(fā)現(xiàn)生理劑量UVA+UVB處理過的黑素細(xì)胞在出現(xiàn)衰老表型后產(chǎn)生攜帶特殊miRNA的外泌體，而這些外泌體miRNA靶向的DNA修復(fù)基因之前已被證明在衰老黑素細(xì)胞中被抑制表達(dá)[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞外泌體所攜帶的干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3（IFITM3）是將衰老信號傳遞給正常細(xì)胞的部分原因[17]。還有學(xué)者認(rèn)為循環(huán)外泌體攜帶的C24：1神經(jīng)酰胺很有可能直接導(dǎo)致細(xì)胞非自主衰老[18]。

除去外泌體傳遞信息的作用，其本身的分泌也是維持細(xì)胞年輕態(tài)的機(jī)制之一。如果外泌體的分泌被抑制，核DNA將在細(xì)胞質(zhì)中積累，繼而細(xì)胞質(zhì)DNA傳感機(jī)制激活，活性氧依賴的DDR發(fā)生，正常人體細(xì)胞則進(jìn)入衰老樣細(xì)胞周期阻滯或凋亡[19]。

3? 外泌體皮膚年輕化作用的轉(zhuǎn)化

外泌體年輕化作用的轉(zhuǎn)化應(yīng)用目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并未見明確的臨床使用報(bào)道，但其巨大的應(yīng)用潛力值得關(guān)注：外泌體作為細(xì)胞間的通訊物質(zhì)，一般能取得比藥物更好的效果;與細(xì)胞本身應(yīng)用相比，效果基本相同，且應(yīng)用具有更大的優(yōu)勢[8]：①避免了非自體細(xì)胞應(yīng)用的免疫排斥問題;②更易保存，不存在長時(shí)間保存后的毒性，且不喪失活性;③在受控的實(shí)驗(yàn)室條件下，通過定制的細(xì)胞系進(jìn)行經(jīng)濟(jì)的批量生產(chǎn)。然而，外泌體的來源、產(chǎn)量及質(zhì)量，外泌體衍生產(chǎn)品開發(fā)相關(guān)的技術(shù)，是限制其進(jìn)一步應(yīng)用的重要原因。一些新的研究成果為大家能夠盡早臨床使用外泌體帶來希望。

3.1 一項(xiàng)研究比較了分別來自三維球體（3D-HDF-XOs）和單層培養(yǎng)的HDFs外泌體：3D-HDF-XOs顯著表達(dá)了更高水平的TIMP-1，使MMP-1表達(dá)下降明顯，并使I型前膠原蛋白表達(dá)增加。此外，其真皮膠原沉積水平顯示高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體。這些結(jié)果提示3D-HDF-XOs具有良好的預(yù)防和治療皮膚衰老的潛力[20]。

有研究通過使用孔徑不斷減小的膜過濾器連續(xù)擠壓IPSC來生成細(xì)胞工程納米囊泡（CENVs），并發(fā)現(xiàn)IPSC-CENVs表現(xiàn)出與IPSC-EXO相似的特性，且產(chǎn)量顯著提高。IPSC-CENVs處理顯著降低了衰老HDFs中與衰老相關(guān)的SA-BETA-GAL活性，并抑制了p53和p21的高表達(dá)，這是參與細(xì)胞周期阻滯、凋亡和細(xì)胞衰老信號通路的關(guān)鍵因素。從中可得，IPSC-CENVs可以作為IPSC-EXO的一個(gè)極好的替代方案，并可作為治療皮膚老化藥物的一種來源[21]。

3.2 有研究顯示人臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在人體皮膚組織上3h后逐漸接近表皮最外層，18h后逐漸接近表皮，處理3d后，I型膠原蛋白和彈力蛋白的表達(dá)增加。此結(jié)果提示了外泌體具有與化妝品或藥物相結(jié)合的潛力[22]。但皮膚表面局部使用外泌體會(huì)由于汗水或淚水而被迅速清除。生物可降解或高孔隙水凝膠已被用來承載外泌體并提供持續(xù)治療效果。水凝膠還可以防止外泌體過早被清除，并且，水凝膠可直接放置在靶區(qū)或接近靶區(qū)，如此外泌體的劑量更集中、更有針對性。但現(xiàn)在封裝干細(xì)胞來源外泌體的技術(shù)研究仍處于早期階段，還存在許多問題，例如：制作水凝膠的原料—交聯(lián)劑所具有的毒性，水凝膠對溫度及pH的敏感性使得水凝膠易凝固從而無法用于注射，外泌體的體內(nèi)動(dòng)力釋放譜無法明確等[23]。

3.3 人工囊泡的概念已被提出：通過化學(xué)反應(yīng)設(shè)計(jì)并將靶向配體插入囊泡表面，使囊泡具有所需的靶向能力;同時(shí)攜帶和轉(zhuǎn)移所需的生物活性物質(zhì)，如治療性miRNA，靶向到目標(biāo)細(xì)胞[24-25]。目前該策略的巨大潛力已在癌癥、神經(jīng)退行性疾病及炎癥方面等得到認(rèn)可，但仍處于發(fā)展早期階段[26]。待其技術(shù)發(fā)展成熟后，不失為外泌體抗皮膚衰老應(yīng)用的另一策略。

4? 小結(jié)

綜上所述，外泌體顯示出在臨床應(yīng)用于皮膚年輕化治療中的重大潛力，不但能改善我們的外觀，更能在一定程度上阻礙皮膚疾病的發(fā)展。目前將其應(yīng)用于皮膚年輕化實(shí)踐的想法尚未得到廣泛關(guān)注，仍需要我們?nèi)ヌ骄科渲械幕钚猿煞?，分析其作用機(jī)制，為外泌體的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)有效的基礎(chǔ)。

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