利用甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b生產(chǎn)四氫嘧啶的研究

王廣交，辛嘉英,，崔添玉，李越，夏春谷

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

四氫嘧啶(1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-吡啶羧酸)是一種普遍存在于嗜鹽微生物中的環(huán)狀亞氨基酸，其可使細(xì)胞在極端環(huán)境下依然保持活性[1-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其可被應(yīng)用于食品[6-7]、醫(yī)療[8-14]、美容等[15-19]領(lǐng)域。由于四氫嘧啶具有一個(gè)手性碳原子，難以化學(xué)合成，故選擇生物法合成四氫嘧啶[20-21]。本文探究甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b合成四氫嘧啶，該菌存在于泥濘的沼澤或水草茂密的池塘，容易獲得，且可以CH4為唯一碳源生長(zhǎng)，使用液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基在較低鹽濃度下合成四氫嘧啶，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，環(huán)境友好，實(shí)用性價(jià)值高。目前合成四氫嘧啶的工業(yè)菌株有限，以期甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b可對(duì)四氫嘧啶的生物合成技術(shù)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b由清華大學(xué)邢新會(huì)教授提供，由本文作者實(shí)驗(yàn)室保存，保存條件為4 ℃，保存過程中定期將菌株重復(fù)培養(yǎng);氯化銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、正丁醇、甲酸、碘、甲醇、乙腈均為分析純；四氫嘧啶，標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)，潤(rùn)慧生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純。

UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)；KH-2000雙波長(zhǎng)薄層色譜掃描儀;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀；U3000高效液相色譜儀；BLBI0-HYG-FJ2生物反應(yīng)器搖床；LDZX-50KBS立式高壓蒸氣滅菌器；SX2-2.5箱式電阻爐；TGL-16高速臺(tái)式離心機(jī)；DL-CG-1ND潔凈工作臺(tái)。

1.2 四氫嘧啶的制備

1.2.1 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基液組成(g/L)：NH4Cl 0.5,K2HPO40.524,KH2PO40.262,KNO31，NaCl 1，Na2HPO40.74,CaCl20.015 1,MgSO40.3,FeCl30.001 67,FeSO40.004,MnSO4·H2O 0.003,ZnSO4·7H2O 0.003 4,NaMoO4·H2O 0.002 4。

1.2.2 甲烷氧化菌的培養(yǎng) 取100 mL培養(yǎng)液于250 mL三角瓶中，將在4 ℃下低溫儲(chǔ)存的種子液以10%的接種量接種在培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)，144 h(6 d)為一個(gè)培養(yǎng)周期，期間每隔24 h充一次CH4(CH4與空氣體積比為1∶1)。

1.2.3 四氫嘧啶的提取 由于四氫嘧啶在甲醇、乙腈、水中溶解度較高[22]，故選擇甲醇、乙腈提取甲烷氧化菌中四氫嘧啶,最終溶解于二次蒸餾水中。取10 mL培養(yǎng)一周期的發(fā)酵液在1 800 r/min條件下，離心20 min，分離上清液與菌種。將上清液在140 r/min,40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用甲醇溶解結(jié)晶，去除不溶沉淀，將溶液再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，使用乙腈溶液溶解結(jié)晶，過濾除去不溶性雜質(zhì)，在140 r/min,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙腈溶液，取10 mL二次蒸餾水溶解結(jié)晶(粗四氫嘧啶)，轉(zhuǎn)移至10 mL試管中，備用。

1.3 分析方法

為排除實(shí)驗(yàn)的偶然性，選用紫外可見光譜儀、薄層色譜、紅外光譜多種定性分析方法分析從甲基彎菌OB3b中提取的樣品。

1.3.1 紫外-可見光譜定性檢測(cè)四氫嘧啶 以水溶解四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(95%純度)，使用UV2450紫外可見光譜儀檢測(cè)四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品在190～230 nm處的紫外吸收，以水溶解提取物在相同檢測(cè)條件下檢測(cè)，比較最大吸收峰位置與峰型。

1.3.2 薄層層析定性檢測(cè)四氫嘧啶 通過薄層色譜輔助紫外-可見光譜實(shí)現(xiàn)快速對(duì)甲烷氧化菌OB3b中提取的四氫嘧啶定性分析。使用GF254型硅膠板，以正丁醇-甲酸-水混合液(V/V/V,6∶2∶2)為展層劑，以碘為顯色劑，使用KH-2000型薄層色譜掃描儀觀測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。

1.3.3 紅外光譜定性檢測(cè)四氫嘧啶 由于紫外-可見光譜與薄層色譜檢測(cè)都存在一定的偶然性，為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,做進(jìn)一步紅外光譜檢測(cè)。取0.25 g KBr研磨均勻，使用壓片機(jī)壓片，將壓片置于紅外光譜儀光路中進(jìn)行背景掃描，扣除KBr與空氣背景。分別將一定量的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品與0.25 g KBr混合均勻，研磨，壓片，掃描，將樣品的紅外光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜進(jìn)行比較。

1.3.4 四氫嘧啶的定量檢測(cè)方法 選用高效液相色譜法，使用 Eclipse XDBC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在柱溫為27.5 ℃柱壓力為35.3 MPa條件下定量檢測(cè)四氫嘧啶。以乙氰/甲醇(體積比為95∶5)混合溶液為流動(dòng)相，流速為1 mL/min的條件下運(yùn)行10 min。標(biāo)準(zhǔn)四氫嘧啶以二次蒸餾水為溶劑,配成0.5 g/L的溶液，使用0.23 μm的水系膜過濾，樣品經(jīng)過同樣的處理，在以上檢測(cè)條件下進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、峰面積及樣品的峰面積計(jì)算樣品的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜檢測(cè)結(jié)果

紫外-可見光譜檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 四氫嘧啶紫外-可見光譜檢測(cè)結(jié)果圖Fig.1 UV-visible spectrum of ectoine

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)品在205 nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，甲烷氧化菌中提取四氫嘧啶最大吸收峰位置在200～205 nm，峰型與標(biāo)準(zhǔn)品幾乎相同。

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，在205 nm下測(cè)定樣品可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的初步快速定性檢測(cè)，并可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在205 nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品快速做出初步的定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.999 8，方程為y=4.292 8x+0.082 4(x為檢測(cè)樣濃度，y為檢測(cè)樣在205 nm處吸光值)。

2.2 薄層層析檢測(cè)結(jié)果

薄層層析檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 TLC定性檢測(cè)甲烷氧化菌O3Bb中四氫嘧啶含量Fig.2 TLC of ectoine from Methylosinus trichosporium OB3b

由圖2可知，四氫嘧啶在硅膠板上出現(xiàn)明顯的點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，其Rf值基本一致,點(diǎn)2有一部分物質(zhì)隨展層劑擴(kuò)散到與標(biāo)準(zhǔn)品相似高度，一部分物質(zhì)未隨展層劑擴(kuò)散，推測(cè)該成分中可能含有羥基四氫嘧啶。由于四氫嘧啶是羥基四氫嘧啶的前體，且他們結(jié)構(gòu)及性質(zhì)極其相似，所以他們經(jīng)常同時(shí)存在并且難以分離，其他菌株合成四氫嘧啶的研究中也存在這一問題。該方法可能可將四氫嘧啶與羥基四氫嘧啶分離開，提高四氫嘧啶純度。

2.3 紅外色譜檢測(cè)結(jié)果

四氫嘧啶的紅外光譜見圖3。

圖3 四氫嘧啶紅外圖譜Fig.3 IR spectrometry of ectoine

由圖3可知，四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品與四氫嘧啶提取樣品的紅外圖譜特征明顯。由于提取樣品純度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品較低，其中含有其他雜質(zhì)，故樣品的紅外光譜發(fā)生藍(lán)移。

根據(jù)以上定性檢測(cè)結(jié)果，可以初步判定甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b在最適鹽濃度下可以合成四氫嘧啶。

2.4 高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果

在最適鹽濃度下培養(yǎng)甲烷氧化菌，使用有機(jī)溶劑提取培養(yǎng)一周期(6 d)后菌種內(nèi)外的四氫嘧啶，為得到均一穩(wěn)定的高效液相色譜圖，將樣品稀釋8～64倍，在紫外檢測(cè)器中檢測(cè)到明顯吸收峰后，在高效液相色譜中進(jìn)樣，將檢測(cè)結(jié)果樣品圖與標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。

圖4 四氫嘧啶高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ectoine

由圖4可知，提取樣品出峰時(shí)間在1.373～1.390 min，峰型與出峰時(shí)間均與標(biāo)準(zhǔn)品相似，說明甲烷氧化菌中含有四氫嘧啶，并可使用該方法定量分析。

2.5 合成四氫嘧啶產(chǎn)量

由檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的峰面積，用式(1)和(2)計(jì)算,細(xì)胞內(nèi)外四氫嘧啶產(chǎn)量和為(84.9±5.49) mg/(g·d)，最大產(chǎn)量為139.75 mg/(g·d)，低于工業(yè)生長(zhǎng)菌株[工業(yè)用菌最大產(chǎn)量為150.5 mg/(g·d)][21]，但略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氫嘧啶的產(chǎn)量(70.4±14.3) mg/(g·d)。 用式(3)計(jì)算釋放率(釋放到細(xì)胞外的四氫嘧啶所占總四氫嘧啶的百分含量),為83.09%～96.63%。

(1)

(2)

(3)

式中A1——標(biāo)準(zhǔn)四氫嘧啶峰面積；

A2——提取四氫嘧啶峰面積；

C1——標(biāo)準(zhǔn)四氫嘧啶濃度，mg/mL；

C2——提取四氫嘧啶濃度，mg/mL；

m1——細(xì)胞干重，g；

V——溶液的體積，mL；

T——培養(yǎng)時(shí)間，d；

Q——四氫嘧啶產(chǎn)量，mg/(L·d)；

m外——細(xì)胞外四氫嘧啶質(zhì)量，mg；

m——細(xì)胞內(nèi)外四氫嘧啶總質(zhì)量,mg；

W——四氫嘧啶釋放率，%。

3 結(jié)論

甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b可以合成并分泌四氫嘧啶，在較低鹽濃度條件下同樣可以合成四氫嘧啶，這可以解決細(xì)胞在高鹽濃度下難以積累以及高鹽濃度對(duì)設(shè)備的損害兩大目前工業(yè)生產(chǎn)所面對(duì)的難題。雖然該菌株合成四氫嘧啶的產(chǎn)量低于工業(yè)生長(zhǎng)菌株[工業(yè)用菌最大產(chǎn)量為150.5 mg/(g·d)]，但其產(chǎn)量略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氫嘧啶的產(chǎn)量(70.4±14.3) mg/(g·d)，并且在后續(xù)研究中培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以使四氫嘧啶的產(chǎn)量得到提高。

與工業(yè)菌株長(zhǎng)鹽單胞菌(Halomonaselongate)相比，甲烷氧化菌可以甲烷為唯一碳源生長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高于以糖為碳源生長(zhǎng)的工業(yè)菌株，使用液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，提取純化工藝相比固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌較簡(jiǎn)單，但甲基彎菌OB3b相比其他菌生長(zhǎng)速度低，待進(jìn)一步研究，以期工業(yè)使用。