不同劑量瑞舒伐他汀對卒中后認(rèn)知障礙(非癡呆)患者循環(huán)相關(guān)miRNA的影響研究

孫曉旭，孫 弋，尹國明，蘇明君，李 強(qiáng)

0 引言

隨著全球人口老齡化及飲食習(xí)慣、生活方式的改變，腦血管事件發(fā)病率逐年升高，我國目前卒中患者已超過7 000萬人，每年新發(fā)200萬人左右，不同地區(qū)的患病率在624/10萬～1 549/10萬[1]。卒中后認(rèn)知障礙(Post-stroke cognitive impairment,PSCI)是卒中后的常見表現(xiàn)，指在多發(fā)性梗死、關(guān)鍵部位梗死、皮質(zhì)下梗死和腦出血等卒中事件后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的一系列綜合征[2]，包括卒中后認(rèn)知障礙非癡呆(Post-stroke cognitive impairment not dementia,PSCIND)和卒中后癡呆。目前PSCI的相關(guān)機(jī)制尚不明確，miRNA是近十年來的研究熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)miRNA可能參與PSCI的病理機(jī)制[3-4]。他汀類藥物的腦保護(hù)作用是本課題組的重點(diǎn)研究問題，高劑量阿托伐他汀可以改善趨化素等脂肪因子水平，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[5]。他汀類對于PSCI的療效和機(jī)制尚不明確，本研究以miR-124[6]、miR-134[7]和miR-138[8]3個(gè)認(rèn)知障礙相關(guān)miRNA為切入點(diǎn)，觀察和分析不同劑量瑞舒伐他汀對于PSCIND患者認(rèn)知功能的改善情況及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究，納入2018年1月至2020年3月于我院住院治療并診斷為PSCIND的患者，共64例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字列表，將患者分為低劑量組和高劑量組，每組各32例。另納入不耐受他汀類藥物或?qū)λ☆愃幬镞^敏的PSCIND患者20例為對照組。入選標(biāo)準(zhǔn)包括：①符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷的急性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②符合2017年中國卒中協(xié)會(huì)制定的PSCIND診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；③腦梗發(fā)病時(shí)間≤1年；④18～80歲；⑤右利手患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①失語、嚴(yán)重聽力或視力障礙患者；②卒中前已存在認(rèn)知功能障礙；③無法配合檢查患者；④合并阿爾茨海默癥、焦慮抑郁癥或其他精神類疾病患者；⑤伴有嚴(yán)重心、肝、腎以及血液系統(tǒng)疾病。所有入選患者均簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 治療方案 對照組患者由于他汀類藥物過敏或不耐受，予以依折麥布治療(商品名：益適純，默沙東，10 mg/片，JX20070201)10 mg/d，并給予腦梗死常規(guī)治療，包括抗凝、抗血小板、調(diào)脂、清除氧自由基、腦保護(hù)、活血化瘀等。低劑量組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，加用瑞舒伐他汀(商品名:可定，阿斯利康，10 mg/片，JX20030283)10 mg/d；高劑量組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，加用瑞舒伐他汀20 mg/d。三組均持續(xù)治療3個(gè)月。

1.3 miRNA檢測 三組患者分別于入組時(shí)(T0)和治療后3個(gè)月(T1)空腹留取肘靜脈血，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心25 min，取上清液，置于-80 ℃凍存待檢。通過Trizol法提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)合成cDNA，cDNA測定通過7600型序列檢測系統(tǒng)(ABI公司)。引物序列分別為：miR-124(正義5′-GATGATGCGCGAGAAGGAGGTT-3′,反義5′-GGGGCGGGCTGCTGTCAT-3′)、miR-134(正義5′-GGGGGCTCGACGGCGTGAT-3′,反義5′-CAGGGTGCGTGTCGGAGT-3′)和miR-138(正義5′-GTCGGCAGCAAGGATAGAATT-3′,反義5′-CGTCACGAATTGGGCCTTATT-3″)。以GADPH作為內(nèi)參，let-7建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照相關(guān)文獻(xiàn)中絕對表達(dá)量的計(jì)算方法[11-12]，計(jì)算血清miR-124、miR-134和miR-138的絕對含量。

1.4 認(rèn)知功能和神經(jīng)功能評估 本研究選擇蒙特利爾認(rèn)知評估(Montreal cognitive assessment，MoCA)[13]、簡易精神狀態(tài)檢查(Mini-mental state examination，MMSE)[14]評價(jià)患者認(rèn)知功能情況，兩者總分均為30分，分值越低，說明認(rèn)知功能越差。MoCA≤25和/或MMSE≤26提示認(rèn)知功能障礙。在治療后3個(gè)月，通過門診或電話進(jìn)行隨訪。計(jì)算治療前后上述評分改善程度：Δ=(T1-T0)/T0×100%。在入組時(shí)選擇美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS)[15]評價(jià)神經(jīng)功能情況。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般資料比較 三組患者在年齡、性別、體重指數(shù)、煙酒史、慢性病分布方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 三組患者治療前后認(rèn)知功能改變情況 組間比較可見，三組患者的MoCA和MMSE在T0和T1時(shí)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而高劑量組的ΔMoCA(U=2.140,P=0.032)和ΔMMSE(U=2.041,P=0.041)均高于對照組。組內(nèi)比較可見，高劑量患者T1時(shí)的MoCA較T0時(shí)明顯升高(t=2.107,P=0.039)，見表2。

表2 三組患者治療前后認(rèn)知功能情況

2.3 三組患者治療前后認(rèn)知障礙相關(guān)miRNAs情況 如表3所示，組內(nèi)比較可見，T1時(shí)低劑量組miR-134(t=2.255，P=0.027)、高劑量組miR-124(t=3.473，P<0.001)、miR-134(t=3.951，P<0.001)和miR-138(t=2.309，P=0.024)，以及對照組miR-124(t=2.155，P=0.035)水平較T0明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較可見，T0時(shí)三組患者miR-124、miR-134和miR-138的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T1時(shí)高劑量組患者miR-134水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.098，P=0.039)。波動(dòng)方面，可見低劑量組、高劑量組和對照組在ΔmiR-124(t低vs.對=2.953，P=0.004；t高vs.對=5.724，P<0.001；t低vs.高=3.765，P<0.001)、ΔmiR-134(t低vs.對=2.988，P=0.004；t高vs.對=4.785，P<0.001；t低vs.高=3.113，P=0.003)和ΔmiR-138(t高vs.對=4.024，t低vs.高=3.431，P均<0.001)的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 三組患者治療前后認(rèn)知障礙相關(guān)miRNAs情況

2.4 不同劑量瑞舒伐他汀、認(rèn)知功能評分和miRNAs之間的相關(guān)性分析 如表4所示，他汀治療與認(rèn)知障礙相關(guān)miRNA(ΔmiR-124、ΔmiR-134和ΔmiR-138)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)波動(dòng)在-0.137～-0.304，其中高劑量他汀治療與ΔmiR-134相關(guān)性最大(r=-0.304，P=0.005)。

表4 不同劑量瑞舒伐他汀、認(rèn)知功能評分和miRNAs之間的相關(guān)性分析(r值/P值)

3 討論

PSCI患者出現(xiàn)不同程度和不同類型的記憶力、執(zhí)行力和注意力的功能受損，嚴(yán)重影響卒中患者生活質(zhì)量[16]。與自然衰老導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙不同，腦卒中引起的認(rèn)知障礙表現(xiàn)為快速性和持續(xù)性的認(rèn)知下降，若得不到及時(shí)有效干預(yù)，最終可能發(fā)展為血管性癡呆，直接影響患者的生存質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量瑞舒伐他汀更有助于改善PSCIND患者認(rèn)知功能水平。同時(shí)，我們選擇了3個(gè)認(rèn)知功能障礙相關(guān)miRNAs(miR-124、miR-134和miR-138)進(jìn)行治療前后對比，發(fā)現(xiàn)高劑量瑞舒伐他汀可下調(diào)這3個(gè)miRNA血清濃度。

他汀類藥物作為一種3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是臨床上最常用的降脂類藥物，屬于卒中患者穩(wěn)定斑塊的常規(guī)治療方案。隨著研究的深入，已證實(shí)他汀類藥物不僅具有降脂效果，還具有抗炎[17]、抗老化以及逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能障礙的作用[18-19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以改善慢性腦低灌注模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[20]。已有研究報(bào)道，他汀類藥物有助于促進(jìn)腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)[5]。有臨床研究證實(shí)，口服瑞舒伐他汀可以通過抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，增加老年血管性癡呆的治療效果，提高患者認(rèn)知功能及生活質(zhì)量[21]。本研究結(jié)果與之相符，我們發(fā)現(xiàn)低劑量組、高劑量組和對照組在治療前后的MoCA評分和MMSE評分均未出現(xiàn)明顯的組間差異，比較治療前后MoCA和MMSE的波動(dòng)程度，可見高劑量組患者治療后MoCA和MMSE升高幅度最大，明顯高于低劑量組和對照組。上述結(jié)果可能是由于本研究觀察時(shí)間較短，以及樣本例數(shù)有限。本研究中，高劑量瑞舒伐他汀組并未出現(xiàn)肝損傷、橫紋肌溶解等不耐受情況。同時(shí)，目前的指南和臨床實(shí)踐認(rèn)為早期強(qiáng)化降脂，達(dá)到目標(biāo)值后可予常規(guī)劑量他汀類藥物。長期高劑量使用他汀類藥物是否增加潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行進(jìn)一步臨床研究。

PSCI的相關(guān)分子機(jī)制至今仍未闡明。本研究從miRNA角度出發(fā)進(jìn)行探索。miRNA是近10年來研究的熱點(diǎn)問題，已發(fā)現(xiàn)大量關(guān)鍵miRNA參與認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)過程。本研究中，我們選擇了已知的3種認(rèn)知障礙相關(guān)miRNA(miR-124、miR-134和miR-138)，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可以降低這3種miRNA水平，而高劑量瑞舒伐他汀效果更為明顯。miR-124是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中已知濃度最高的miRNA，主要存在于突觸前感覺神經(jīng)元中，在海馬區(qū)高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)下游關(guān)鍵蛋白，參與長時(shí)程記憶的形成[22]。miR-134高表達(dá)于神經(jīng)元樹突，可抑制興奮性突觸后部位樹突棘的大小，從而調(diào)控突觸成熟過程和可塑性[7]。miR-138與miR-134類似，富集于神經(jīng)元樹突，通過調(diào)控下游乙?；鞍琢蝓ッ刚{(diào)控樹突棘的大小[8]。目前尚無他汀類藥物對于這3種認(rèn)知相關(guān)miRNA的作用報(bào)道，在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證瑞舒伐他汀對于這3種miRNA的影響。

綜上所述，本研究針對PSCIND患者，通過分析治療前后3種認(rèn)知相關(guān)miRNA水平波動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀有助于改善PSCIND患者認(rèn)知功能水平，以及下調(diào)miR-124、miR-134和miR-138濃度。