鉛、鋅、鎘脅迫對(duì)多年生黑麥草生長及生理生化特性的影響

張茂, 徐彥紅, 席溢, 裴應(yīng)杰, 黃本用, 楊克超, 李金孟

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 貴陽 550025)

鉛(Pb)、鋅(Zn)、鎘(Cd)常以工業(yè)、農(nóng)業(yè)廢棄物的形式進(jìn)入環(huán)境中，并通過食物鏈流動(dòng)對(duì)人造成威脅[1]。Pb是一種非氧化還原活性重金屬，積累過多會(huì)破壞植物結(jié)構(gòu)和功能，引起多年生黑麥草蒸騰作用和生長速率的下降[2]。Zn作為植物生長發(fā)育的必需元素，具有調(diào)節(jié)光合作用，控制蛋白合成，促進(jìn)植物生長等重要功能，植物生理屏障對(duì)Zn的毒性具有一定的抵抗力，當(dāng)Zn過量后植物會(huì)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)、抗氧化酶、蛋白質(zhì)等對(duì)自身進(jìn)行解毒[3]。Cd是植物的非必需元素，在根部大量積累，容易造成多年生黑麥草出現(xiàn)綠化現(xiàn)象，阻礙營養(yǎng)元素吸收，進(jìn)而抑制植物生長[4]。

多年生黑麥草(LoliumperenneL.)為禾本科黑麥草屬草本植物，具有分蘗快、生長快、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且有研究發(fā)現(xiàn)，多年生黑麥草可富集多種重金屬。多年生黑麥草對(duì)Cd2+的吸收作用大于Pb2+，修復(fù)輕度Pb2+和Cd2+的污染效果明顯[5]。研究表明，多年生黑麥草富集重金屬能力順序?yàn)椋篫n2+>Cd2+>Pb2+[6]。Zn2+濃度為300 mg·kg-1時(shí)，能促進(jìn)植物的生長，過量Zn2+改變細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)價(jià)值等，間接威脅人類和動(dòng)物的健康[7]。

土壤重金屬污染已成為生態(tài)恢復(fù)過程中亟需解決的問題，目前利用植物進(jìn)行土壤重金屬恢復(fù)存在研究材料富集能力單一、生長緩慢等問題，本文研究了不同濃度Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對(duì)多年生黑麥草生長發(fā)育及生理生化特性的影響，探究多年生黑麥草對(duì)不同重金屬的耐受性及修復(fù)土壤重金屬污染的潛力，旨在為生態(tài)恢復(fù)提供理論支撐和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草種為黑麥草品種‘雅晴’(Yatsyn)，購于北京正道生態(tài)科技有限責(zé)任公司。供試重金屬為Pb(NO3)2、Zn(NO3)2·6H2O、Cd(NO3)2·4H2O，購于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在貴州大學(xué)西校區(qū)崇學(xué)樓開展。挑選飽滿、健康的種子，采用雙層濾紙法培養(yǎng)。待出現(xiàn)2片真葉時(shí)，挑選長勢(shì)相近的幼苗移栽至直徑29.5 cm、高21.5 cm的塑料花盆中，每盆5株。砂培法栽種，每盆石英砂重8 kg，每周定期澆灌Hoagland營養(yǎng)液。根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]，并結(jié)合前人研究，Pb2+設(shè)0(CK)、500(Pb500)、1 000(Pb1 000)、2 000(Pb2 000)mg·kg-1四個(gè)處理，Zn2+設(shè)0(CK)、500(Zn500)、1 000(Zn1 000)、2 000(Zn2 000)mg·kg-1四個(gè)處理，Cd2+設(shè)0(CK)、10(Cd10)、20(Cd20)、50(Cd50)mg·kg-1四個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。移栽后第14 d(2017年12月13日)開始測(cè)量株高和葉寬，此后每2周測(cè)量一次。第127 d收獲植株，進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

生理指標(biāo)檢測(cè)均參考張蜀秋等[9]方法，株高測(cè)定垂直高度，葉寬測(cè)定葉片最寬處，活性愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(peroxidase，POD)活性；氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；脯氨酸(proline，Pro)含量采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法測(cè)定；硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)，蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量；95%乙醇浸提法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

應(yīng)用Fuzzy隸屬函數(shù)法[10]進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，與多年生黑麥草重金屬抗逆性呈正相關(guān)的參數(shù)用式(1)，呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)用式(2)。

U(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

U(X)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中，U(X)為多年生黑麥草對(duì)重金屬的隸屬度，且0≤U(X)≤1，X為某一指標(biāo)的測(cè)定值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS 20.0對(duì)測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草株高和葉寬的影響

不同處理多年生黑麥草的株高和葉寬結(jié)果(表1)可見，隨著Pb2+、Zn2+、Cd2+濃度的增強(qiáng)，多年生黑麥草的株高呈降低趨勢(shì)，各處理與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；Pb2 000處理14 d時(shí)，株高為Pb2+處理的最低值，為4.18 cm，僅為CK的33.71%；Zn1 000處理14 d時(shí)，株高為Zn2+處理的最小值，為4.65 cm，僅為CK的37.5%；Cd50處理14 d時(shí)，為Cd2+處理的最小值，株高為6.78 cm，為CK的55.4%。隨著Pb2+、Zn2+、Cd2+濃度增強(qiáng)，多年生黑麥草的葉寬表現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)，Zn1 000處理14 d時(shí)，葉寬最小，為0.85 cm，僅為CK的31.84%。Cd2+脅迫對(duì)多年生黑麥草的株高和葉寬影響最小，Pb2+和Zn2+脅迫對(duì)多年生黑麥草的影響類似。Pb2+、Zn2+和Cd2+顯著抑制了多年生黑麥草的生長，且隨著種植時(shí)間的延長，不同金屬離子脅迫處理的株高并沒有顯著增加，只有葉寬在Pb500、Pb1 000、Cd10處理127 d時(shí)顯著增加，說明多年生黑麥草體內(nèi)的重金屬并不會(huì)降解，重金屬對(duì)植物生長的抑制作用持續(xù)存在。Pb500、Pb1 000、Cd10處理127 d時(shí)，葉寬增加可能是因?yàn)橹亟饘匐x子濃度較低或葉片對(duì)重金屬耐受性高于其他器官等綜合作用的結(jié)果。

表1 不同濃度Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草的株高和葉寬

2.2 Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草生物量、根長和分蘗數(shù)的影響

由表2可知，Pb2+脅迫時(shí)，隨濃度增加，地上生物量呈先增加后減小趨勢(shì)，Pb500脅迫時(shí)最大，顯著高于其他處理，為對(duì)照的1.78倍；地下生物量隨濃度增加呈減小趨勢(shì)，但Pb500處理與CK無顯著差異，Pb1 000和Pb2 000處理的地下生物量顯著低于CK。Zn2+脅迫下，多年生黑麥草地下生物量隨著濃度升高表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。處理Zn500、Zn1 000、Zn2 000和Cd50的根冠比較CK顯著增加(P<0.05)，說明這些處理對(duì)多年生黑麥草的地上部影響更大；而Pb500、Pb1 000、Pb2 000、Cd10和Cd20處理的根冠比與CK處理無顯著差異。Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫處理的分蘗數(shù)和根長均較CK處理顯著降低(P<0.05)。綜上，輕度Pb2+、Zn2+、Cd2+處理對(duì)多年生黑麥草的影響較小，3個(gè)Zn2+處理均顯著抑制多年生黑麥草的地上和地下生物量，可能是因?yàn)?00 mg·kg-1Zn2+已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多年生黑麥草對(duì)Zn2+的耐受閾值。

表2 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫下多年生黑麥草的生物量、分蘗數(shù)、根長

2.3 Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草光合色素含量的影響

不同Pb2+、Zn2+、Cd2+處理的多年生黑麥草光合色素含量結(jié)果(表3)可見，所有處理的葉綠素含量均與對(duì)照組無顯著差異，Pb2 000處理的葉綠素a含量較CK處理顯著降低25%(P<0.05)。Zn500處理的葉綠素a、類胡蘿卜素和光合色素含量均較CK顯著降低(P<0.05)。Cd50處理的葉綠素b含量較CK處理顯著增加96%。Zn500處理的類胡蘿卜素、葉綠素和光合色素含量最低，比CK分別降低了32%、21%、23%。

表3 Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草光合色素含量的影響

2.4 Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)多年生黑麥草抗氧化酶的影響

由圖1可知，在低濃度Pb2+脅迫時(shí)，多年生黑麥草SOD活性與對(duì)照組差異不顯著，隨著Pb2+濃度增加，SOD活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Zn2+對(duì)多年生黑麥草SOD活性的影響表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì)，僅Zn500處理與CK有顯著差異(P<0.05)，為CK的4.28倍。Cd10、Cd20、Cd50處理的SOD活性均與CK處理無顯著差異。這說明Pb1 000、Zn500處理能激活多年生黑麥草的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行防御。

Pb2+、Zn2+處理的多年生黑麥草POD 活性均較CK顯著增強(qiáng)，Pb500活性最大，為3 262.33 U·g-1，是CK的2.53倍，Cd10、Cd20、Cd50處理的多年生黑麥草POD活性與CK間均無顯著差異。說明Pb2+、Zn2+在濃度為500 mg·kg-1時(shí)，能激活多年生黑麥草的SOD和POD 活性進(jìn)行防御，而Cd2+脅迫SOD和POD 活性未被激活。

2.5 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對(duì)多年生黑麥草MDA含量的影響

由圖2可知，多年生黑麥草的MDA含量隨著Pb2+濃度增加呈現(xiàn)先下降后增加趨勢(shì)，Pb500、Pb1 000、Pb2 000三個(gè)處理均與CK差異顯著(P<0.05)，Pb2 000處理的MDA含量最大，是CK的3.60倍。MDA含量隨著Zn2+、Cd2+濃度增加呈線性增加趨勢(shì)，Zn2+、Cd2+脅迫處理均與CK處理差異顯著(P<0.05)，均在濃度為2 000 mg·kg-1時(shí)增加到最大值，分別是CK的4.20、3.55倍。表明隨著Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫逐漸增強(qiáng)，加大了多年生黑麥草的膜脂過氧化過程，MDA生成增加。

2.6 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對(duì)多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3可知，不同濃度Pb2+處理的多年生黑麥草可溶性糖含量間有顯著差異(P<0.05)，Pb500、Pb1 000處理均較CK顯著降低，Pb500處理達(dá)到最小值，為1.76 g·kg-1，Pb2 000處理較CK顯著增加，可溶性糖含量達(dá)到7.23 g·kg-1。隨著Zn2+濃度的增大，多年生黑麥草可溶性糖含量表現(xiàn)為先升高后下降趨勢(shì)，均與CK差異顯著(P<0.05)，Zn500處理達(dá)到最大值，為7.83 g·kg-1，Zn2 000處理可溶性糖含量最小，為2.65 g·kg-1。Cd2+脅迫下，多年生黑麥草可溶性糖的含量均顯著低于CK(P<0.05)，Cd10處理的可溶性糖含量降到最小，為1.4 g·kg-1。說明低濃度的Pb2+和Cd2+脅迫會(huì)抑制多年生黑麥草可溶性糖的產(chǎn)生，低濃度Zn2+脅迫能促進(jìn)多年生黑麥草可溶性糖的產(chǎn)生。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性。

多年生黑麥草脯氨酸含量隨著Pb2+、Zn2+、Cd2+濃度升高，不同濃度處理的脯氨酸含量均顯著高于CK處理(P<0.05)，Pb2 000、Zn2 000、Cd50處理分別為Pb2+、Zn2+、Cd2+處理的最大值，脯氨酸含量分別為CK的1.98、1.93、1.93倍。表明Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫能顯著促進(jìn)多年生黑麥草脯氨酸的生成。多年生黑麥草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量累積，可以減輕或避免重金屬對(duì)多年生黑麥草的傷害。

2.7 多年生黑麥草對(duì)重金屬耐受性的綜合評(píng)價(jià)

利用隸屬函數(shù)法對(duì)多年生黑麥草11個(gè)抗逆性生理生態(tài)指標(biāo)進(jìn)行分析，對(duì)不同處理進(jìn)行排序，結(jié)果(表4)表明，多年生黑麥草植物對(duì)Pb2+、Zn2+、Cd2+的抗逆性由強(qiáng)到弱依次為：Zn500>CK>Zn1 000>Cd10>Pb500>Zn2 000>Cd20>Pb1 000>Pb2 000>Cd50。

表4 多年生黑麥草對(duì)重金屬Pb2+、Zn2+、Cd2+耐受性的綜合評(píng)價(jià)

3 討論

3.1 Pb2+、Zn2+、Cd2+抑制多年生黑麥草的生長

Pb2+、Zn2+、Cd2+是土壤污染中的主要污染物，在植物中積累過量后會(huì)嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育，甚至死亡[11]，所有研究材料的株高、分蘗數(shù)、地上生物量均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，地下生物量則逐漸降低[12]。Pb100-400、Zn100-400促進(jìn)黑麥草幼苗的生長，Cd1-10抑制黑麥草幼苗的生長[13]。在受到Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+等重金屬污染的環(huán)境中，植物的生物量減小，其中Zn2+脅迫下生物量降低最多，與對(duì)照植物相比下降了95%[14]。在Zn25、Zn50、Zn100時(shí)，水稻(OryzasativaL.)幼苗的生物量降低，生長受阻，且濃度越大抑制作用越顯著[15]。本研究結(jié)果表明，Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫下多年生黑麥草的株高、葉寬、根長、分蘗數(shù)均顯著低于對(duì)照組，僅有Pb500、Pb1 000、Cd10處理時(shí)差異性不顯著，Pb500對(duì)地下生物量和Pb1 000對(duì)地上生物量的影響不顯著，其余均顯著。重金屬被植物吸收并在器官中轉(zhuǎn)移，阻礙根系生長和分蘗能力，且隨著時(shí)間的增加對(duì)多年生黑麥草的抑制作用并未降低。

3.2 Pb2+、Zn2+、Cd2+影響多年生黑麥草的葉片葉綠素含量

光合作用是植物獲取能量的一個(gè)重要方式，而葉綠素含量與植物進(jìn)行光合作用有密切關(guān)系。在重金屬Pb2 +脅迫下，多年生黑麥草的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量均顯著高于對(duì)照組，Cd2+的脅迫下，多年生黑麥草的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量在濃度低于10 mg·kg-1時(shí)顯著高于對(duì)照組，濃度繼續(xù)增加，植物各葉綠素含量變化不明顯[5]。在Zn2+和Mn2+的脅迫下，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量及葉綠素a/b的比值比對(duì)照組均顯著降低[16]。隨著Cd2+濃度增大，多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均輕微降低，但并無顯著性差異[17]。本研究中多年生黑麥草在低濃度Pb2+脅迫下，葉綠素含量均無顯著差異，在濃度大于1 000 mg·kg-1時(shí)，葉綠素a顯著低于對(duì)照組，Zn500脅迫下多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、光合色素含量均顯著低于對(duì)照，Cd10脅迫下葉綠素b含量顯著高于對(duì)照組。與方鑫等[16]研究結(jié)果相同,可能是多年生黑麥草對(duì)Zn2+比較敏感，對(duì)Pb2+有一定的耐受性，對(duì)Cd2+有特殊的應(yīng)激機(jī)制[18]。

3.3 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫引起滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累

脯氨酸和可溶性糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖的積累能夠增強(qiáng)植物的耐受性[19]，當(dāng)Pb2+濃度低于1 000 mg·kg-1時(shí)，黑麥草的脯氨酸含量隨著Pb2+濃度的增大而增大，Pb2+濃度高于1 000 mg·kg-1時(shí)，黑麥草的脯氨酸含量隨著Pb2+濃度的增大逐漸減少，在長時(shí)間高濃度處理下，可溶性糖含量不成規(guī)律性變化最終趨于減少[20]。Zn2+脅迫下小麥(TriticumaestivumL.)幼苗根、葉中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加，根中脯氨酸的增加率大于葉片[21]。當(dāng)大麥(HordeumvulgareL.)處于Al3+、Cd2+脅迫時(shí)，植物葉片的脯氨酸含量顯著增加[22]。在本研究中多年生黑麥草脯氨酸含量隨著重金屬含量增加而增加，可溶性糖含量變化復(fù)雜，研究結(jié)果與前人研究基本一致，重金屬脅迫會(huì)打破植物細(xì)胞中活性氧與自由基之間的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，此時(shí)植物細(xì)胞通過分泌大量脯氨酸和可溶性糖等逆境保護(hù)物質(zhì)用于緩解重金屬的傷害。

3.4 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫激活抗氧化酶活性

為了抑制逆境脅迫對(duì)植物的氧化損傷，植物形成了復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)保護(hù)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)[23]，對(duì)兩個(gè)品種高羊茅耐受性的研究發(fā)現(xiàn)，在Pb1 000脅迫下，植物的POD、SOD活性顯著增加[24]，14種禾本科牧草對(duì)重金屬Pb2+耐受性的研究發(fā)現(xiàn)，植物的POD、SOD及CAT活性先增后減[12]。Zn2+處理小麥、玉米(ZeamaysLinn.)研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+濃度為200、900 mg·kg-1時(shí)SOD活性顯著低于對(duì)照，450 mg·kg-1處理與對(duì)照組無顯著差異，Zn2+處理的小麥SOD活性在整個(gè)試驗(yàn)過程中增加，玉米的SOD活性降低[25]。本研究中，Pb2+脅迫下多年生黑麥草的SOD、POD活性均顯著增高，Zn2+脅迫下SOD先增后減、POD活性均顯著增高，Cd脅迫下多年生黑麥草SOD、POD活性均有不同程度的升高，但差異性不顯著。這與Hu等[24]研究結(jié)果一致，與李慧芳等[12]、Alonso-Blázquez等[25]研究結(jié)果不同。當(dāng)重金屬進(jìn)入細(xì)胞并引起結(jié)構(gòu)變化時(shí)，抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮了特殊作用，植物通過分泌大量的抗氧化酶來去除有害物質(zhì)，維持植物的生長，但重金屬濃度過大會(huì)破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)甚至導(dǎo)致植物死亡。

3.5 綜合評(píng)價(jià)Pb2+、Zn2+、Cd2+對(duì)黑麥草的影響

本研究綜合評(píng)價(jià)表明，多年生黑麥草對(duì)Pb2+、Zn2+、Cd2+有一定的耐受性，抗逆性由強(qiáng)到弱依次為：Zn500> CK > Zn1 000> Cd10> Pb500> Zn2 000> Cd20> Pb1 000> Pb2 000> Cd50。前人研究表明，植物在一定范圍的Pb2+、Cd2+脅迫下會(huì)增加植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶來減小對(duì)植物的危害，Cd2+濃度為10 mg·L-1時(shí)對(duì)植物的根和地上部分的生長有促進(jìn)作用，大多植物對(duì)Pb2+、Cd2+脅迫表現(xiàn)為低促高抑[26-28]，重金屬對(duì)植物的毒性為Pb2+>Zn2+[29]。本研究中，低濃度的Zn2+對(duì)多年生黑麥草的抗逆性表現(xiàn)出促進(jìn)作用，高濃度具有抑制作用，抗逆性由強(qiáng)到弱依次為：Zn2+>Cd2+>Pb2+，這與楊卓等[6]研究結(jié)果相似，同時(shí)也驗(yàn)證了多年生黑麥草作為重金屬修復(fù)生物材料的可行性。