太行菊屬植物根際土壤微生物多樣性初步研究

景曉雅, 孫柳清, 李尚彧, 高亞楠, 吳云鋒, 王祎玲, 陳偉*

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西 臨汾041000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)干旱區(qū)作物脅迫生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 楊凌712100)

太行菊屬(OpisthopappusShih)屬于菊科(Asteraceae)菊亞族，屬下有2個(gè)種，分別為太行菊[Opisthopappustaihangensis(Ling)Shih]和長(zhǎng)裂太行菊(OpisthopappuslongilobusShih)，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。太行菊屬植物主要分布在我國(guó)的山西、河北、河南等省，為我國(guó)太行山脈的特有屬[2]，大多生長(zhǎng)在海拔1 000 m左右的懸崖峭壁石縫中以及峭壁下疏林內(nèi)的巖石縫隙和土層瘠薄處，抗逆性較好，被廣泛用于菊花種質(zhì)改良[3]。目前，由于其分布范圍持續(xù)縮小，已處于瀕危狀態(tài)，被河南省和河北省列為瀕危保護(hù)植物[4]。太行菊屬植物作為我國(guó)的特色種質(zhì)資源, 在特殊生境中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，對(duì)環(huán)境改善、生態(tài)平衡等具有重要應(yīng)用價(jià)值。

植物作為生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，根際土壤微生物是其有機(jī)質(zhì)的分解者，兩者形成了穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。植物將光合產(chǎn)物以根系分泌物和植物殘?bào)w的形式釋放到土壤，供給土壤微生物以碳源和能源；而微生物則將有機(jī)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)養(yǎng)分，以利于植物吸收利用[5-6]。這種植物-微生物-土壤的相互作用維系或主宰了生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能，為系統(tǒng)內(nèi)所有生物適應(yīng)逆境提供了重要保障[7-8]。目前對(duì)擬南芥[9]、大豆[10]、大麥[11]、玉米[12]、水稻[13]、野燕麥[14]等植物的根際土壤微生物多樣性進(jìn)行了大量研究，其中最常見(jiàn)的細(xì)菌類群有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等。根際放線菌的種類相對(duì)于細(xì)菌而言較少，主要是鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單孢菌屬(Micromonospora)等。而最常見(jiàn)的鐮刀菌屬(Fusarium)、粘帚霉屬(Gliocladium)、青霉屬(Penicillium)等真菌，也是根際微生物的重要組成部分。植物根際聚集的這些大量微生物，參與土壤有機(jī)物質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成及氨化作用，并拮抗土壤中的病原菌等過(guò)程，可加快根際土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與儲(chǔ)存，刺激植物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收[15]。根際微生物還對(duì)磷有活化作用，同時(shí)可促進(jìn)鉀、錳、鐵、鋅等元素的釋放，為植物生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)元素[14,16]。此外，微生物也可通過(guò)影響植物根系生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)育等生理特性，而間接影響根系吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的范圍和潛力，進(jìn)而影響植物的生態(tài)適應(yīng)性[17]。總之，在植物-微生物-土壤三者形成的穩(wěn)定根際生態(tài)系統(tǒng)中，根際豐富的微生物在一定程度上增強(qiáng)了生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)植物的演化和適生。從根際微生物角度探討植物演化和生態(tài)適生機(jī)制是世界范圍的研究熱點(diǎn)，是眾多交叉學(xué)科研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一[15]。

本研究分析了太行菊屬兩個(gè)物種的根際土壤理化性質(zhì)，并對(duì)其根際土壤微生物多樣性進(jìn)行檢測(cè)和分析，系統(tǒng)研究了太行菊屬植物根際微生物的遺傳多樣性，解析其生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，為太行菊屬植物的合理開(kāi)發(fā)和科學(xué)保護(hù)提供重要的理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及樣品采集

于2017年8—10月，對(duì)太行菊屬植物太行菊(O.taihangensis)和長(zhǎng)裂太行菊(O.longilobus)的自然分布區(qū)進(jìn)行野外調(diào)查和樣本采集，選取長(zhǎng)裂太行菊的兩個(gè)樣地：山西紅豆峽(Hongdouxia,HDX)和河南高家臺(tái)(Gaojiatai,GJT)，太行菊的兩個(gè)樣地：河南關(guān)山(Guanshan,GS)和河南青龍峽(Qinglongxia,QLX)，共4個(gè)樣地，樣地詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品采集的樣地信息

除去土壤表層未分解的凋落物層，用已滅菌的鏟去除表層5 cm土壤，再用土壤取樣器取樣10～25 g，裝于無(wú)菌塑料封口袋內(nèi)，用冰袋運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。除去動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜質(zhì)，將大塊樣品搗碎，過(guò)2 mm篩后，分裝至2 mL的凍存管中，-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

稱取兩個(gè)太行菊屬植物GS、QLX、HDX、GJT 4個(gè)樣地的風(fēng)干土樣1 g，放入試管，加無(wú)菌水2.5 mL，加塞后充分搖動(dòng)試管，待溶液澄清后，用BPH-7100A pH測(cè)量?jī)x(貝爾分析儀器有限公司)測(cè)量土壤浸出液pH，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

依據(jù)林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[18-20]測(cè)量土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3 土壤微生物多樣性測(cè)定

1.3.1土壤總DNA提取與分析 取GS、QLX、HDX、GJT 4個(gè)樣地的土樣，采用CTAB法提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Nanodrop，美國(guó))分析抽提DNA濃度和純度。選取完整且質(zhì)量較好的材料用于后續(xù)研究。

1.3.2土壤細(xì)菌和真菌的DNA測(cè)定 以制備好的DNA為模板，細(xì)菌以細(xì)菌通用引物(V3-V4)338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)為引物，真菌用真菌通用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)為引物，用擴(kuò)增試劑盒KT121221(TianGen，中國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果，選取條帶單一、亮度較好的樣品使用DNA凝膠回收試劑盒DP208(TianGen,中國(guó))進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物送上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.3.3序列處理與分析 測(cè)序后獲得原始序列，經(jīng)修剪、去除嵌合體序列及非特異性擴(kuò)增序列等優(yōu)化處理后，提取非重復(fù)序列，采用RDP classifier貝葉斯算法[21]，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行物種分類學(xué)分析、Pan/Core 物種分析和Alpha多樣性分析。根據(jù)有效序列數(shù)量進(jìn)行物種相對(duì)豐度、物種Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和蓋度的計(jì)算和分析。通過(guò)與EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中的COG功能分類(Non-supervised Orthologous Groups，http://eggn og.embl.de/)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際土壤的細(xì)菌和真菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 相關(guān)性分析

用SPSS 22.0軟件對(duì)太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際土壤微生物豐富度與土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，用R 3.6.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 太行菊和長(zhǎng)裂太行菊不同樣地的根際土壤理化性質(zhì)

對(duì)太行菊和長(zhǎng)裂太行菊共4個(gè)樣地的根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行初步分析, 結(jié)果(表2)表明，GS、QLX、HDX、GJT樣地的堿解氮含量分別為50.3、56.6、43.8、42.4 mg·kg-1，速效磷含量分別為17.8、16.9、15.6、13.7 mg·kg-1，速效鉀含量分別為80.7、81.8、57.7、61.7 mg·kg-1?？梢?jiàn)，太行菊兩個(gè)樣地的根際土壤有效養(yǎng)分整體高于長(zhǎng)裂太行菊的兩個(gè)樣地，但兩地土壤的堿解氮、速效磷、速效鉀含量明顯偏低，土壤較貧瘠。4個(gè)樣地的土壤pH均為7左右，近中性。

表2 太行菊屬植物根際土壤理化性質(zhì)

2.2 長(zhǎng)裂太行菊和太行菊不同樣地的土壤微生物多樣性

2.2.1土壤微生物種類統(tǒng)計(jì) 為從微生物的角度探討太行菊屬植物的生存適應(yīng)機(jī)制，排除環(huán)境因素的干擾，分別將太行菊與長(zhǎng)裂太行菊的各個(gè)樣本，進(jìn)行綜合分析?；陂L(zhǎng)裂太行菊的兩個(gè)樣地之間的土壤理化性質(zhì)較相似，對(duì)長(zhǎng)裂太行菊的HDX和GJT樣地，太行菊的GS和QLX樣地統(tǒng)一進(jìn)行土壤微生物多樣性分析。高通量測(cè)序結(jié)果(表3)顯示，太行菊根際共獲得63 266條有效細(xì)菌DNA序列，獲得了942個(gè)OTU，鑒定出細(xì)菌19 門43 綱87 目176 科297 屬503 種；共獲得63 789條有效真菌DNA序列，獲得了548個(gè)OTU，共鑒定出真菌5 門20 綱58 目103 科185 屬261 種。

表3 太行菊屬植物根際土壤微生物種類統(tǒng)計(jì)

長(zhǎng)裂太行菊根際共獲得53 069條有效細(xì)菌DNA序列，以相似度97%為閾值，獲得了890個(gè)OTU(97%相似性的非重復(fù)序列)，鑒定出細(xì)菌21 門42 綱87 目164 科268 屬449 種；共獲得53 478條有效真菌DNA序列，獲得了383個(gè)OTU，共鑒定出真菌5 門20 綱48 目87 科150 屬202 種。

2.2.2土壤微生物門水平的分析 太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際土壤細(xì)菌在門水平的豐度分析(表4)顯示，太行菊的細(xì)菌門中，放線菌門(Actinobacteria)占比最高，為42.50%，其次是變形菌門(Proteobacteria，24.78%)、酸桿菌門(Acidobacteria，14.11%)、綠彎菌門(Chloroflexi，8.54%)，其余15個(gè)細(xì)菌門占比10.07%；真菌門中，子囊菌門(Ascomycota)占比86.83%，其次是擔(dān)子菌門(Basidiomycota，6.44%)，未知菌門(unclassified)占比5.35%，接合菌門(Zygomycota)占比1.21%，球囊菌門(Glomeromycota)占比0.17%。可見(jiàn)，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門細(xì)菌是太行菊植物的根際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，子囊菌門是太行菊的根際優(yōu)勢(shì)真菌門。Unclassified-Ascomycoat、Norank-Chaetthyriales、Norank-Ascomycota、Norank-Pleosporales、Unclassified-Fungi的豐度分別占36.09%、11.01%、9.09%、5.42%、5.35%，為優(yōu)勢(shì)真菌科。

表4 太行菊屬植物根際土壤的優(yōu)勢(shì)微生物門及其豐富度

長(zhǎng)裂太行菊中，放線菌門(Actinobacteria)在根際細(xì)菌種類占比最高，為59.08%，其次是綠彎菌門(Chloroflexi，14.37%)、變形菌門(Proteobacteria，12.06%)、酸桿菌門(Acidobacteria，6.52%)，其他15個(gè)細(xì)菌門占比7.97%；真菌門中，子囊菌門(Ascomycota)占比88.31%，其次是接合菌門(Zygomycota，8.89%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota，1.96%)、未知菌門(unclassified，0.75%)、壺菌門(Chytridiomycota，0.10%)?？梢?jiàn)，放線菌門、綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門是長(zhǎng)裂太行菊根際土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，子囊菌門是長(zhǎng)裂太行菊的根際優(yōu)勢(shì)真菌門。瓶口衣科(Verrucariaceae)、Unclassified-Ascomycoat、叢赤殼科(Nectriaceae)、Unclassified-Chaetothyriales、和norank-Ascomycota的豐度分別占15.64%、14.31%、12.17%、11.01%和9.55%，為長(zhǎng)裂太行菊的根際優(yōu)勢(shì)真菌科。

2.2.3土壤微生物的種水平分析 太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際土壤中鑒定出402種共有根際細(xì)菌，其中太行菊有101個(gè)特有種，長(zhǎng)裂太行菊有47個(gè)特有種(圖1)。太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際土壤中鑒定出128種共有根際真菌，太行菊有133個(gè)特有種，長(zhǎng)裂太行菊有74個(gè)特有種(圖1)。

對(duì)兩個(gè)太行菊屬植物根際土壤的細(xì)菌和真菌豐富度進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果(圖2)顯示，太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際土壤中，有281種細(xì)菌在豐富度方面存在極顯著差異，其中功能細(xì)菌有66種，功能涉及抗逆、固氮、碳循環(huán)等。太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際土壤中，有15種真菌存在豐富度的顯著差異，包含石果衣(Endocarponpusillum)、Acremoniumblochii、Podosporacommunis、白色側(cè)齒霉菌(Engyodontiumalbum)等多種功能真菌。

注：* 表示該OTU在兩個(gè)物種間的差異在P<0.05水平具有顯著性，**表示該OTU在兩個(gè)物種間的差異在P<0.01水平具有顯著性。

Alpha多樣性分析顯示，太行菊根際細(xì)菌的Chao指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為497.01、4.78和0.04；根際真菌Chao指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 指數(shù)分別為205.23、2.81和0.08。長(zhǎng)裂太行菊根際細(xì)菌的Chao指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為488.37、4.56和0.03；根際真菌Chao指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 指數(shù)分別為207.83、3.10和0.08?？梢?jiàn)，太行菊根際細(xì)菌多樣性指數(shù)均大于長(zhǎng)裂太行菊，而其根際真菌多樣性指數(shù)均小于長(zhǎng)裂太行菊。表明根際微生物多樣性的差異也反映了太行菊和長(zhǎng)裂太行菊兩個(gè)物種間的差異，在一定程度上支持太行菊與長(zhǎng)裂太行菊為兩個(gè)種的適生演化結(jié)論。

2.2.4土壤微生物的功能分析 太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際土壤的細(xì)菌和真菌功能分析結(jié)果(表5)顯示，太行菊屬根際存在大量功能微生物參與DNA修復(fù)、跨膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝等過(guò)程。詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際微生物中，有15種參與氮循環(huán)、9種參與光合功能、8種參與抗逆相關(guān)功能等過(guò)程。這些具有豐富功能的微生物為太行菊屬植物在特殊生境生存提供了重要保障。其中，長(zhǎng)裂太行菊的氮循環(huán)、碳循環(huán)和光合功能微生物的豐富度均高于太行菊，而太行菊的抗逆功能微生物的豐富度高于長(zhǎng)裂太行菊，化能功能微生物在太行菊和長(zhǎng)裂太行菊之間幾乎沒(méi)有差異。

2.4 相關(guān)性分析

為探究土壤理化性質(zhì)與根際微生物多樣性之間的關(guān)系，對(duì)太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)與其相應(yīng)根際土壤的pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果(表6)表明，太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際細(xì)菌多樣性與堿解氮、速效磷、速效鉀含量均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，兩個(gè)物種的根際細(xì)菌多樣性與土壤pH均表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際真菌多樣性與土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀含量均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。可見(jiàn)，土壤理化性質(zhì)對(duì)太行菊屬植物的根際微生物多樣性具有顯著影響，且土壤養(yǎng)分的影響更大。

3 討論

太行菊屬植物生長(zhǎng)在懸崖峭壁，生長(zhǎng)環(huán)境惡劣。本研究發(fā)現(xiàn)，其根際土壤中可直接利用的N、P、K營(yíng)養(yǎng)元素含量較低。根際微生物種類分析發(fā)現(xiàn)，其根際土壤中存在大量具有固氮、解磷、解鉀功能的微生物。這些功能微生物可能通過(guò)自身代謝參與礦物質(zhì)的分解、氨化作用等[22]，將礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的無(wú)機(jī)養(yǎng)分，提高太行菊屬植物根際土壤中可吸收利用的養(yǎng)分，而太行菊屬植物通過(guò)根的分泌物，將光合作用產(chǎn)物通過(guò)根和殘?bào)w供給微生物碳源和能源，這樣兩者形成了較為穩(wěn)定的互利共生微環(huán)境[23-24]，利于太行菊屬植物在較貧瘠的土壤環(huán)境生存。

本研究發(fā)現(xiàn)，太行菊和長(zhǎng)裂太行菊的根際微生物在種類、數(shù)量、豐富度、優(yōu)勢(shì)菌群等方面都存在一定差異；有281種細(xì)菌在豐富度方面存在極顯著差異，15種真菌存在顯著差異，太行菊根際細(xì)菌多樣性指數(shù)均大于長(zhǎng)裂太行菊，而其根際真菌多樣性指數(shù)均小于長(zhǎng)裂太行菊。導(dǎo)致這種物種間差異的原因可能是：首先，兩個(gè)物種的生長(zhǎng)環(huán)境不同。長(zhǎng)裂太行菊采自山西省紅豆峽和河南省高家臺(tái)，太行菊采自河南省關(guān)山和青龍峽，采集地在降水、溫度、光照等環(huán)境因素間存在一定差異，從而影響土壤微生物的種類和多樣性。其次，長(zhǎng)裂太行菊與太行菊為了適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境，開(kāi)始適生進(jìn)化，逐漸演化形成兩個(gè)種[25]，并通過(guò)其根及分泌物進(jìn)一步作用于土壤微生物，從而引起土壤微生物種類、豐富度等方面出現(xiàn)差異。此外，土壤理化性質(zhì)的差異也是根際微生物差異的重要原因，對(duì)比兩個(gè)物種根際土壤理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)太行菊與長(zhǎng)裂太行菊的土壤pH、堿解氮、速效磷和速效鉀含量均存在差異，這種差異可以直接或間接地作用于土壤微生物[25-26]，從而影響土壤微生物種類、數(shù)量和分布。相關(guān)性分析顯示，太行菊屬植物的根際微生物多樣性與土壤養(yǎng)分成顯著負(fù)相關(guān)性(表5)，說(shuō)明土壤養(yǎng)分的差異是造成太行菊和長(zhǎng)裂太行菊根際微生物差異的重要原因。本研究為進(jìn)一步解析太行菊屬植物的特殊生境適應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為太行菊屬屬下分類提供了借鑒意義。