PCPA對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)P450scc、CB1R、MAP2基因表達(dá)的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用研究

石 鵬，滕 柳，郭海波，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

神經(jīng)甾體是一類存在于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)的一類甾體化合物。神經(jīng)甾體很早就被認(rèn)為具有鎮(zhèn)靜、麻醉和抗癲癇的作用。神經(jīng)甾體是神經(jīng)興奮性的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)中合成的神經(jīng)甾體會(huì)通過非基因組機(jī)制影響CNS的興奮性[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成神經(jīng)甾體需要以膽固醇為原料，P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450 cholesterol side chain cleavage，P450scc)位于線粒體內(nèi)膜，能將膽固醇催化形成孕烯醇酮(Pregnenolone，PREG)，是神經(jīng)甾體合成中的限速步驟，神經(jīng)甾體與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，能快速改變神經(jīng)興奮性[2]。有關(guān)研究[3]表明，大麻素受體1(Cannabinoid receptor1，CB1R)、微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP2)也是神經(jīng)甾體的作用靶點(diǎn)。CB1R在大腦中廣泛表達(dá)，PREG是CB1受體的負(fù)向別構(gòu)分子，神經(jīng)甾體通過CB1R與焦慮、抑郁相關(guān)。PREG通過充當(dāng)激動(dòng)劑與MAP2特異性結(jié)合，在腦發(fā)育、突觸可塑性、抑郁中具有一定作用[4]。目前，學(xué)界認(rèn)為中樞五羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)與皮層興奮性密切相關(guān)。5-HT與神經(jīng)甾體均能參與中樞興奮性的調(diào)節(jié)，但二者在中樞興奮性調(diào)節(jié)中的相互作用尚不清楚。對(duì)氯苯丙氨酸(Para-chlorophenyl alanine，PCPA)是色氨酸羥化酶的不可逆抑制劑，可以有效阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，降低腦內(nèi)5-HT含量，廣泛應(yīng)用于睡眠-覺醒研究中[5]。酸棗仁湯(Suanzaoren decoction，SZRD)是治療失眠的經(jīng)典方劑，研究顯示酸棗仁湯對(duì)參與睡眠-覺醒調(diào)節(jié)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)控作用[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠腹腔注射PCPA，觀察大鼠腦內(nèi)5-HT下降后，皮質(zhì)P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達(dá)情況及酸棗仁湯的干預(yù)作用，探討5-HT與神經(jīng)甾體的相互作用關(guān)系，揭示酸棗仁湯治療失眠的潛在機(jī)制。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：NO.SCXK(湘)2014-0011。在恒溫(22±2)℃、安靜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)條件符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理和實(shí)驗(yàn)相關(guān)要求。

1.2 藥物儀器及試劑

PCPA(C-6506，Sigama公司)；酸棗仁湯(酸棗仁、川芎、茯苓、知母、炙甘草)于北京同仁堂貴陽店購買；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5203，上海亞榮生化儀器廠)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；超微量分光光度計(jì)(德國Implen公司)；Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)，RT-PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物準(zhǔn)備

酸棗仁湯依據(jù)第五版《方劑學(xué)》教材：稱取酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g，10劑共460 g。加8倍水浸泡1 h，煎煮1 h，紗布濾過，藥渣加入6倍水煎煮30 min過濾藥液，合并兩次藥液旋蒸濃縮至含生藥量1.5 g/mL的濃縮藥液[7]，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)按需取用水浴復(fù)溫。

PCPA懸浮液配制：PCPA按350 mg/kg計(jì)算稱取用量[1]，置于研缽內(nèi)間斷少量加入生理鹽水持續(xù)研磨30 min，配制成PCPA懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆茫褂们俺浞只靹颉?/p>

2.2 動(dòng)物分組及給藥

大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、PCPA組、SZRD組、PCPA+SZRD組，每組10只。正常組不做任何處理，PCPA組和PCPA+SZRD組按350 mg/kg腹腔注射PCPA，對(duì)照及SZRD組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)6天。第7天起SZRD組和PCPA+SZRD組以7.5 g/kg劑量，10 mL/kg體積灌胃SZRD，對(duì)照組和PCPA組灌胃等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)8天。

2.3 取材

末次給藥2 h后，以10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，冰上迅速取出腦組織，去除腦干、嗅球，分離皮質(zhì)置于標(biāo)記好的預(yù)冷EP管中，液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物設(shè)計(jì)

引物使用Primer5.0設(shè)計(jì)，上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表1。

表1 引物序列及大小

2.5 RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)條件

Trizol法提取總RNA，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，樣本純度均符合1.8～2.0標(biāo)準(zhǔn)，隨即按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR參照說明書采用20 μL體系，反應(yīng)條件為：UDG酶激活50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般情況

PCPA腹腔注射3天后與對(duì)照組相比可見大鼠飲食減少，白天活動(dòng)增加，攻擊性增強(qiáng)，皮毛無光澤，出現(xiàn)一系列腦內(nèi)5-HT濃度下降表現(xiàn)[1]。

3.2 PCPA對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)P450scc、CB1R、MAP2 mRNA的影響

與對(duì)照組比較，PCPA組P450scc mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，CB1R mRNA表達(dá)下降(P<0.01)，MAP2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3.3 酸棗仁湯的干預(yù)作用

與PCPA組比較，PCPA+SZRD組P450scc mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，CB1R mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，MAP2 mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，SZRD組P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

4 討論

神經(jīng)甾體及其代謝產(chǎn)物在皮層興奮性、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)保護(hù)等方面具有廣泛作用[8]。5-HT也與皮層興奮性關(guān)系密切，目前尚不明確5-HT和神經(jīng)甾體間的功能關(guān)系。PCPA是研究中樞5-HT與其他神經(jīng)遞質(zhì)功能關(guān)系的經(jīng)典藥物[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，PCPA能導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)P450scc表達(dá)增加，CB1R、MAP2表達(dá)下降，酸棗仁湯能降低P450scc表達(dá)，上調(diào)CB1R、MAP2受體表達(dá)。對(duì)照組與正常組比較，P450scc、CB1R、MAP2表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明灌胃、腹腔注射等侵襲性操作對(duì)上述指標(biāo)無明顯影響。

表2 各組大鼠皮質(zhì)P450scc、MAP2、CB1受體mRNA表達(dá)情況

神經(jīng)甾體的合成和代謝過程需要多種酶的參與，P450scc是神經(jīng)甾體生成中關(guān)鍵的酶之一[10]。星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞均可表達(dá)P450scc[11]，其中P450scc mRNA主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量眾多且分布廣泛，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和突觸活動(dòng)，與睡眠-覺醒關(guān)系密切，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和功能方面具有重要作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCPA腹腔注射能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達(dá)[12]。還有研究[13]顯示，在癲癇的病理過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性細(xì)胞并表達(dá)高水平的P450scc，從而成為神經(jīng)甾體合成的主要參與者。因此，筆者推測本實(shí)驗(yàn)腹腔注射PCPA后上調(diào)的P450scc可能主要來源于激活后的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，孕期胎兒腦中具有較高濃度的神經(jīng)甾體物質(zhì)，使得胎兒在孕期大部分時(shí)間都處于類似睡眠的行為狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦內(nèi)5-HT含量下降后，P450scc表達(dá)增加可能意味著大鼠腦內(nèi)神經(jīng)甾體含量的波動(dòng)，這可能是導(dǎo)致睡眠-覺醒異常的原因，酸棗仁湯的干預(yù)作用可能是恢復(fù)腦內(nèi)神經(jīng)甾體水平，其具體機(jī)制還有待深入研究。

目前學(xué)界認(rèn)為，神經(jīng)甾體主要通過GABAA受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的調(diào)節(jié)，神經(jīng)甾體作用于GABAA受體后能使其介導(dǎo)的Cl-通道開放，氯離子內(nèi)流增加產(chǎn)生抑制性電流，參與中樞興奮性的調(diào)節(jié)，使神經(jīng)甾體在狂躁、焦慮、抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面具有一定的臨床潛力[15]。CB1受體存在于GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元富集的區(qū)域且參與了信息傳遞過程，因此可以認(rèn)為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)能夠參與調(diào)控興奮或抑制性神經(jīng)傳遞，具有雙向調(diào)控作用[16]。有關(guān)研究[17]顯示，通過CB1受體介導(dǎo)的內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于非快速眼動(dòng)睡眠的穩(wěn)定是必要的。5-HT2C受體和CB1受體之間存在相互作用從而調(diào)控大鼠睡眠-覺醒模式[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCPA導(dǎo)致CB1R表達(dá)下降，這也表明5-HT與CB1R在睡眠-覺醒調(diào)節(jié)中可能也存在相互作用，酸棗仁湯可能通過增加CB1R的表達(dá)影響皮層興奮性，其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

MAP2是調(diào)節(jié)微管蛋白組成的重要調(diào)節(jié)因子，在穩(wěn)定微管、神經(jīng)元發(fā)育、突觸可塑性等方面具有重要作用[19]。有學(xué)者[20]將MAP2作為神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物，相關(guān)研究顯示，快速眼動(dòng)睡眠剝奪后大鼠皮層MAP2表達(dá)減少且能觀測到髓鞘溶解等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PCPA組與對(duì)照組比較，MAP2表達(dá)下降。筆者研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCPA能導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)微透析液中谷氨酸的含量增加[21]，能上調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)中代謝型谷氨酸受體mGluR1、mGluR2的表達(dá)[22]，還能增加N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的表達(dá)[23]。因此，可推測PCPA導(dǎo)致MAP2表達(dá)降低的機(jī)制可能是：過度激活的NMDA和代謝型谷氨酸受體，通過Ca2+通道導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，胞內(nèi)Ca2+超載等途徑引起的細(xì)胞毒性從而導(dǎo)致MAP2降解。

睡眠障礙可能增加多種心血管疾病及代謝性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[24]。睡眠的調(diào)節(jié)與皮層興奮性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，探究5-HT與神經(jīng)甾體的功能關(guān)系，有利于進(jìn)一步明確皮層興奮性的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而為失眠的治療提供新的治療靶點(diǎn)，酸棗仁湯可能通過調(diào)節(jié)P450scc、CB1R、MAP2的表達(dá)對(duì)失眠發(fā)揮治療作用，這可能是酸棗仁湯治療失眠的潛在機(jī)制之一。