意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

滕 亮，李蒙華，馬桂芝

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830054；2. 陜西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 7100683.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

近幾年，我國心血管病死亡率居高不下，心血管病已成為危害人民群眾健康的重要問題。溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)或冠狀動脈旁路移植術(shù)能充分的開通梗死相關(guān)血管，恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，搶救瀕臨死亡的心肌，是缺血性心臟病、急性心肌梗死的最有效措施。但再灌注治療在恢復(fù)冠脈血流的同時會加重組織損傷，出現(xiàn)心功能不全、心律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大等嚴(yán)重現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[1]，其損傷機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬及細(xì)胞焦亡等[2-5]。

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)為紫草科牛舌草屬多年生草木植物，分布于地中海和熱帶地區(qū)，是維吾爾醫(yī)治療心腦血管疾病首選藥材之一[6]。近期研究已證實意大利牛舌草總黃酮具有減少缺氧/復(fù)氧所致原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用[7-8]，課題組進(jìn)一步對意大利牛舌草總黃酮提取物進(jìn)行了化學(xué)成分分離，獲得多個單體化合物，如蘆丁(含量為4.3%)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(含量為5.6%)、水仙苷(含量為3.8%)、迷迭香酸(含量為19.5%)，其中蘆丁、水仙苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷均為黃酮類化合物[9]，具有明確的抗氧化、抗炎活性[10]，但其對缺氧/復(fù)氧所致原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制仍有待于研究。

因此，本研究以意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分(蘆丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷)為研究對象，觀察其在體外對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率、LDH水平、細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD的活力的影響，通過檢測線粒體膜電位、心肌細(xì)胞凋亡、NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白與其凋亡、自噬、焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究意大利牛舌草總黃酮及四種主要化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧所致原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為深入開展意大利牛舌草中活性成分的藥理作用研究及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器DMI6000型全自動熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；ChemiDoc MP凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低溫冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；MultiskanGo酶標(biāo)儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司)；FACSAria II流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 試劑蘆丁對照品(批號MUST-18031811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品(批號MUST-18041504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.06%)，水仙苷對照品(批號MUST-18070403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.99%)，迷迭香酸對照品(批號MUST-18040508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.30%)，葛根素(批號：16031432)均購自成都曼思特生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：A020-2-2)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：A001-3-2)，丙二醛(MDA)試劑盒(批號：A003-4)均購自中國南京建成生物工程研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences公司，批號：9009907)；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(中國博士德生物工程有限公司，批號：AR1160-500)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，批號：AE29427345)；胎牛血清(美國Giboco公司，批號：GR3289926)；鼠抗β-actin抗體(英國Abcam公司，批號：ab8226)；兔抗GAPDH抗體(美國Affinity公司，批號：620922)；兔抗NF-κB p65抗體(英國Abcam公司，批號：ab16502)；兔抗NF-κB p-p65抗體(英國Abcam公司，批號：ab86299)；兔抗Bcl-2抗體(英國Abcam公司，批號：ab59348)；兔抗Bax抗體(英國Abcam公司，批號：ab32503)；兔抗NF-κB1p50抗體(美國CST 公司，批號：13586)；兔抗IKκBα抗體(美國CST 公司，批號：4812)；兔抗p-IKκBα抗體(美國CST 公司，批號：2859)；兔抗Beclin-1抗體(美國CST 公司，批號：3495s)；兔抗IL-1β抗體(英國Abcam公司，批號：ab2105)；鼠抗GSDMDC1抗體(德國圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號：C2218)；鼠抗Caspase-1抗體(德國圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號：J1618)；抗鼠2抗(HRP)(美國CST 公司，批號：7056)；抗兔2抗(HRP)(美國CST 公司，批號：7074s)。

1.3 實驗動物健康 SPF 級 SD大鼠乳鼠，雌雄各半，體質(zhì)量( 6.49±2.06) g，鼠齡 1-3 d，均由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(新) 2019-0003。實驗過程中對動物的處理均遵照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.4 意大利牛舌草總黃酮的制備[9]取意大利牛舌草藥材，粉碎后過40目篩，回流提取料液比為1 ∶20，提取溶劑為75%乙醇，提取時間為2 h，共提取2次。過濾后，合并濾液，濃縮至無醇味，冷凍干燥，即得意大利牛舌草總黃酮的粗提物。取1 BV濃度為20 g·L-1意大利牛舌草總黃酮粗提物溶液，上樣至聚酰胺柱中，上樣速度為2 BV·h-1，上樣后靜態(tài)吸附30 min，用足量蒸餾水去除雜質(zhì)，以70%乙醇為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥至粉末狀，即得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.81%的提取物。

1.5 原代乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)[8]取1-3 d新生乳鼠心臟，剪為花瓣樣后置于1 mL·L-1胰酶中4 ℃搖床消化過夜。次日用等體積的完全培養(yǎng)液中和胰酶后，加入0.8 mL·L-1Ⅱ型膠原酶置于37 ℃水浴搖床，使組織完全消化。收集上清液，離心，用完全培養(yǎng)液重懸得細(xì)胞懸液，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，在CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁2次純化心肌細(xì)胞，收集未貼壁細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個·L-1，接種于100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。置于常規(guī)培養(yǎng)箱(含5% CO2和95% O2)中靜置培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)時加入終濃度為10 mL·L-1Brdu抑制纖維細(xì)胞的生長。

1.6 分組與給藥取培養(yǎng)48 h的原代心肌細(xì)胞饑餓12 h(無糖無血清培養(yǎng)基)，隨機(jī)分為正常對照組(Control)、模型組(H/R model )、蘆丁組(50 mg·L-1)、迷迭香酸組(25 mg·L-1)、水仙苷組(25 g·L-1)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷組(100 mg·L-1)、總黃酮組(50 mg·L-1)、葛根素組(陽性對照組，1240 mg·L-1)。

正常對照組(Control)將細(xì)胞用100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。模型組(HR)將細(xì)胞置于缺氧密閉裝置(含95% N2和5% CO2)中培養(yǎng)12 h(缺氧)，培養(yǎng)基更換為含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min(復(fù)氧)。空白組中無細(xì)胞，僅加入與各組等量的培養(yǎng)基，其余處理與模型組相同。藥物干預(yù)組(蘆丁組、迷迭香酸組、水仙苷組、山奈酚-3-O-蕓香糖苷組、總黃酮組、葛根素組)均為給予細(xì)胞指定濃度的干預(yù)藥物預(yù)處理一定時間后，參照模型組進(jìn)行缺氧及復(fù)氧處理。

1.7 CCK-8法檢測心肌細(xì)胞活力將各組細(xì)胞置于96孔板上，每組設(shè)6個復(fù)孔，按照1.6項下分組處理后，加入CCK-8溶液(100 μL·孔-1)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm波長處測定吸光度值(A)，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/%= (A實驗組- A空白組)/(A正常組- A空白組)×100%，重復(fù)測定3次。

1.8 LDH、MDA和SOD的測定收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定LDH的水平。心肌細(xì)胞提取蛋白后，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定SOD的活性和MDA的含量。

1.9 JC-1染色測定線粒體膜電位各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，棄去培養(yǎng)皿上清液，用37 ℃的無菌PBS清洗2遍；每個培養(yǎng)皿加入500 μL JC-1染色液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育10min。取出培養(yǎng)皿，吸取JC-1染色液，棄去，用無菌PBS清洗，每次5 min，共洗3次；迅速拿至熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照。各實驗組每組3皿，重復(fù)3次。

1.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，按照凋亡試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞凋亡率。

1.11 Western blot法測定心肌細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，按蛋白提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳對蛋白進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉膜1 h，4 ℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗2 h，顯色，通過凝膠成像分析儀對目的條帶拍照，采用Image Lab 4.0灰度分析軟件測定目標(biāo)蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞存活率的影響Tab 1顯示，相較于正常組，H/R模型組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預(yù)組均可以增加H/R損傷細(xì)胞的存活率，差異有顯著性(P<0.01)，提示蘆丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、總黃酮均可提高損傷心細(xì)胞的活力。

2.2 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞LDH、SOD、MDA的影響Tab 2顯示，與正常對照組比較，經(jīng)H/R處理后的模型組細(xì)胞LDH水平和MDA含量升高，SOD活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示H/R處

Tab 1 Effect of total flavonoids and four compounds on survival rate of cardiac myocytes exposed to

Tab 2 Effect of total flavonoids and four compounds on contents of LDH, MDA and activity of SOD of cardiac

理后對細(xì)胞造成了損傷；與模型組比較，藥物干預(yù)組乳鼠心肌細(xì)胞LDH水平和MDA含量均明顯降低，SOD活性均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明藥物干預(yù)可修復(fù)H/R造成的細(xì)胞損傷。

2.3 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌線粒體膜電位的影響Fig 1顯示，心肌細(xì)胞在經(jīng)過缺氧/復(fù)氧后，紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度較正常組比例明顯下降(P<0.01)，提示H/R可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體膜電位的下降；與模型組比較，藥物干預(yù)組的心肌細(xì)胞紅色熒光/綠色熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)(P<0.01)，提示各給藥組可提高心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平，進(jìn)而穩(wěn)定線粒體功能，發(fā)揮保護(hù)受損心肌細(xì)胞的作用。

2.4 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig 2顯示，相較于正常對照組，H/R模型組心肌細(xì)胞早期凋亡比例明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞早期凋亡比例均明顯下降(P<0.01)，說明各藥物可通過減少心肌細(xì)胞早期凋亡發(fā)揮保護(hù)受損心肌細(xì)胞的作用。保護(hù)作用的強(qiáng)弱順序依次為總黃酮>蘆丁>葛根素>水仙苷>山奈酚-3-O-蕓香糖苷>迷迭香酸。

Fig 1 Mitochondrial membrane potential of

2.5 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞NF-κB信號通路蛋白的影響Fig 3顯示，H/R后原代心肌細(xì)胞NF-κB被激活后，發(fā)生磷酸化， p-IκBα與IκBα比值較正常對照組明顯減低，p-p65水平較正常對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，藥物預(yù)處理后p-IκBα與IκBα比值表較H/R上調(diào)，p-p65水平較H/R組明顯降低(P<0.01)，提示在H/R前進(jìn)行給藥干預(yù)可通過減少NF-κB的磷酸化有效抵抗缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞損傷。

2.6 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig 4顯示，相較于對照組，心肌細(xì)胞經(jīng)過H/R后促凋亡蛋白Bax與抑制凋亡蛋白Bcl-2的比例明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，給藥組的Bax/Bcl-2的比例較模型組明顯降低(P<0.01)，說明在H/R前進(jìn)行給藥干預(yù)可有效抵抗缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

2.7 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響Fig 5顯示，相較于對照組，心肌細(xì)胞經(jīng)過H/R后自噬蛋白Beclin-1表達(dá)量明顯增高，自噬蛋白p62表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而給藥組的Beclin-1蛋白表達(dá)量較模型組明顯降低而p62表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，說明在H/R前進(jìn)行給藥干預(yù)可通過抑制細(xì)胞自噬有效抵抗缺氧/復(fù)氧對心肌細(xì)胞的損傷。

2.8 意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分對缺氧/復(fù)氧原代心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的影響Fig 6結(jié)果顯示，相較于對照組，心肌細(xì)胞經(jīng)過H/R后NLRP3、IL-1β以及GSDMD表達(dá)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而給藥組的NLRP3、IL-1β以及GSDMD表達(dá)量較模型組明顯降低(P<0.01)，說明在H/R前進(jìn)行給藥干預(yù)有效抑制炎癥小體的活性，進(jìn)而減少炎癥反應(yīng)，降低心肌細(xì)胞焦亡。

3 討論

MIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2-5]，發(fā)生MIRI時，心肌細(xì)胞氧自由基增多，抗氧化能力降低。本實驗結(jié)果表明，意大利牛舌草總黃酮及其主要成分蘆丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚3-O-蕓香糖苷均能夠提高心肌細(xì)胞的活力，抵抗心肌細(xì)胞的過度氧化，增強(qiáng)SOD的活力，且總黃酮對造模后細(xì)胞活力的提升和抗氧化應(yīng)激能力高于4種單體成分，推測其對H/R損傷后細(xì)胞保護(hù)作用可能與總黃酮提取物中多種成分協(xié)同作用有關(guān)。

Fig 2 Primary cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation

在預(yù)實驗中作者分別考察了意大利牛舌草總黃酮及其主要成分蘆丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚3-O-蕓香糖苷的不同作用劑量(1、5、25、50、100、1 000 mg·L-1)與不同作用時間(1、3、5、7 h)對H/R損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。經(jīng)優(yōu)選，確定各受試物作用條件為：蘆丁50 mg·L-1預(yù)處理3 h、迷迭香酸25 mg·L-1預(yù)處理3 h、水仙苷25 mg·L-1預(yù)處理3 h、山奈酚-3-O-蕓香糖苷100 mg·L-1預(yù)處理3 h、總黃酮50 mg·L-1預(yù)處理1 h和陽性藥葛根素1 240 mg·L-1預(yù)處理2 h。

心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致MIRI的一個重要因素，主要爆發(fā)于再灌注期間[11]，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可促心肌細(xì)胞凋亡[3]。 NF-κB通常指由Rel蛋白家族的p50和p65組成的二聚體，是一種具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)，許多基因啟動子和增強(qiáng)子上具有功能性NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，包括與心肌缺血發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的TNF-α、白細(xì)胞介素和內(nèi)皮粘附因子，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[12]。靜止細(xì)胞中NF-κB與其抑制蛋白IκBk形成復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)中不起作用。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外炎癥信號的刺激時， IκB 磷酸化并降解，NF-κB 游離，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，對炎癥反應(yīng)起放大作用，進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13]。本文結(jié)果表明藥物干預(yù)組心肌細(xì)胞中p-p65水平較H/R組明顯降低，p-IκBα與IκBα比值較H/R組上調(diào)(P<0.01)，提示藥物干預(yù)可減少心肌細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制NF-κB信號通路，減少炎癥因子釋放而發(fā)揮作用。

Fig 3 Expression of NF-κB signaling pathway-related proteins detected by Western blot

Bcl-2家族主要包括促凋亡蛋白Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl兩大類，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的基因蛋白，其在線粒體內(nèi)高度表達(dá)，維持線粒體內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，阻止開放線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔，達(dá)到對促進(jìn)凋亡蛋白質(zhì)釋放的抑制，抑制細(xì)胞凋亡。Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因蛋白，Bax的表達(dá)是通過和線粒體上Bcl-2結(jié)合成二聚體來發(fā)揮作用。當(dāng)Bax表達(dá)增多時，Bax、Bax同源二聚體便可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Akt磷酸化使Bax表達(dá)減少時，Bcl-2、Bax異源二聚體便可抑制細(xì)胞凋亡[14]。本文結(jié)果顯示，藥物干預(yù)組心肌細(xì)胞的Bax/Bcl-2比例較模型組明顯降低(P<0.01)，藥物干預(yù)可有效抵抗缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Fig 4 Expressions of apoptosis-related proteins detected by Western blot

Fig 5 Expressions of autophagy-related proteins detected by Western blot

Fig 6 Expressions of pyroptosis-related proteins detected by

細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡的方式之一，自噬體是由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中被雙層膜包裹的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器裂解物形成的，主要功能是降解細(xì)胞內(nèi)的多余的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，使細(xì)胞保持正常狀態(tài)，同時為細(xì)胞提供一定的能量。但是，當(dāng)這些反應(yīng)過度發(fā)生時，出現(xiàn)過度自噬現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，自噬在心臟細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)中起著重要作用[15]。本實驗結(jié)果顯示，給藥組的自噬蛋白Beclin-1表達(dá)量較模型組明顯降低，而自噬蛋白p62表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，提示藥物干預(yù)可通過抑制細(xì)胞自噬，有效抵抗缺氧/復(fù)氧對心肌細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞焦亡是一種介于凋亡和壞死之間的伴隨炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡形式，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷膨脹直至胞膜破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)容物的釋放和強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)的激活。發(fā)生焦亡后的細(xì)胞，細(xì)胞核的核膜仍然保持完整，但會釋放大量的IL-1β和IL-18，進(jìn)而募集更多的炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。MIRI發(fā)生時，NF-κB持續(xù)激活促進(jìn)炎癥小體NLRP3形成，炎癥小體一旦形成，通過活化caspase-1進(jìn)一步促進(jìn)前體IL-1β及IL-18的成熟，使之形成有活性的IL-1β和IL-18，在GSDMD的介導(dǎo)下分泌到細(xì)胞外，募集炎癥細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促使細(xì)胞腫脹，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞焦亡[16-17]，加重再灌注損傷。本實驗結(jié)果顯示，給藥組的NLRP3、IL-1β以及GSDMD較模型組明顯降低，提示藥物干預(yù)可有效抑制炎癥小體的活性，進(jìn)而減少炎癥反應(yīng)，降低心肌細(xì)胞焦亡。

綜上所述，本文結(jié)果表明意大利牛舌草總黃酮及四種化學(xué)成分可減輕H/R對心肌細(xì)胞造成的損傷，這種保護(hù)作用與抑制NF-κB信號通路的激活及心肌細(xì)胞的過度自噬、緩解細(xì)胞焦亡、減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。