白藜蘆醇抑制人肝微粒體代謝色氨酸的研究

吳棟麗，汪 靜，陳 爽，鐘詩龍

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515； 2.廣東省人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所，廣東省冠心病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東 廣州 510080)

白藜蘆醇是天然多酚類植物抗毒素，在虎杖、葡萄、花生、桑葚等植物中廣泛分布。白藜蘆醇以其抗氧化的特性而廣為人知，例如清除多種活性氧(reactive oxygen species，ROS)、自由基、活性氮，增強(qiáng)過氧化氫酶等抗氧化防御酶的表達(dá)，在維持細(xì)胞氧化還原平衡中具有重要意義[1-2]。此外，白藜蘆醇還具有抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集等多種生理活性[3-4]。

色氨酸(tryptophan，TRP)是人體必需氨基酸，機(jī)體主要有3條代謝途徑，分別是5-羥色胺途徑，犬尿氨酸途徑及經(jīng)腸道菌群代謝的吲哚途徑[5]。約95%的色氨酸經(jīng)過犬尿氨酸途徑代謝，主要代謝產(chǎn)物有犬尿氨酸(kynurenine，KYN)、犬尿喹啉酸(kynurenic acid， KYNA)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic，3-HAA)；該途徑可以調(diào)控機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中的色氨酸水平。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是犬尿氨酸途徑的關(guān)鍵酶。犬尿氨酸途徑代謝失衡與心血管疾病、免疫抑制、神經(jīng)系統(tǒng)活動等緊密相關(guān)[6-7]。血漿中的犬尿氨酸被認(rèn)為是為慢性心力衰竭的生物標(biāo)志物[8]。KYN/TRP比值水平反映IDO的活性。KYN/TRP比值是冠狀動脈疾病患者發(fā)生主要不良冠狀動脈事件和全因死亡的預(yù)測因子[7]。犬尿氨酸途徑也是先天性和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其下游代謝物如犬尿氨酸、3-羥基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3-HK)、喹啉酸(quinolinic acid，QA)和吡啶甲酸(picolinic acid，PA)都被證實(shí)具有免疫抑制作用[9]。KYNA和QA被認(rèn)為是N-甲基天冬氨酸受體的拮抗劑和激動劑，二者之間的平衡決定了神經(jīng)元的興奮性狀態(tài)；常與精神分裂癥和抑郁有關(guān)[10]。

白藜蘆醇可以上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中間隙連接蛋白-43(connexin 43，Cx43)的表達(dá)，并且能抑制IDO蛋白的表達(dá)[11]。此外，白藜蘆醇能夠抑制干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)的骨髓樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)中IDO的表達(dá)和活性[12]。由此可見，白藜蘆醇發(fā)揮抗腫瘤作用可能與抑制IDO有關(guān)。而目前暫無白藜蘆醇是否影響犬尿氨酸途徑代謝相關(guān)研究的報(bào)道，關(guān)于肝微粒體代謝色氨酸的研究也很少。因此，本研究基于體外人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系，探討白藜蘆醇對犬尿氨酸途徑代謝的影響；為進(jìn)一步研究白藜蘆醇的藥理作用機(jī)制及色氨酸代謝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器LC-20A高效液相色譜儀(Shimadzu)，配有電噴霧電離(ESI)源的API 4000 QTrap三重四極桿質(zhì)譜儀(AB Sciex)；Milli-Q純化系統(tǒng)(EMD Millipore,Billerica)；DSHZ-300A 水浴鍋(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；Toledo XA205 分析天平(梅特勒公司)；Allegra X-30R 臺式高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coutler)；Vortex-5 渦旋振蕩器(其林貝爾 Kylin-bell)。

1.2 藥物與試劑色氨酸(TRP，99%，J&K Scientific，批號：LAB0R08)；犬尿氨酸(KYN，>98%，阿拉丁，批號：C1907148)；色氨酸-d5和犬尿氨酸-d4(TRP-d5，98%；KYN-d4，98%；Toronto Research Chemicals，批號分別為：2-LXM-187-1；4-MOZ-161-3)；Epacadostat(Epa，98%，薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司(安耐吉化學(xué))，批號：GA250269)；活性炭(100目粒度，Sigma-Aldrich，批號：MKBQ5057V)；白藜蘆醇(Res，>99%，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，批號：ZFBCC-RA)；HPLC級乙腈和甲醇(Thermo Fisher Scientific，批號分別為：JA067630；WXBC9577V)；HPLC級甲酸(Sigma-Aldrich，批號：77Y1211RS)；混合人肝微粒體(HLM,蛋白質(zhì)量濃度為20 g·L-1，瑞德肝臟疾病研究上海有限公司，批號：VIN)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，95%，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：RH108167)；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，氯化鎂(K2HPO4，99%；KH2PO4，99.5%；MgCI2，99%；上海麥克林生化科技有限公司，批號分別為：C10084223，C10091971，M21918024)；黃素腺嘌呤二核甘酸(FAD，Sigma-Aldrich，批號：SLBS5158)。

1.3 LC-MS/MS分析方法應(yīng)用AB Sciex API4000 QTrap三重四極桿質(zhì)譜儀，電噴霧電離(ESI)，正離子源，在多反應(yīng)檢測(MRM)模式下掃描?；镜馁|(zhì)譜參數(shù)：電噴霧電壓(IS)為5 500 V；氣簾氣壓力(CUR)25 psi；霧化氣壓力(GS1)50 psi；輔助氣壓力(GS2)50 psi；離子源溫度(TEM)550 ℃。MRM模式監(jiān)測反應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)：205.1→146.1(TRP)，210.3→192.2(TRP-d5)，209.1→94.1(KYN)，181.3→164.0(KYN-d4)，具體質(zhì)譜參數(shù)如Tab 1所示。

島津LC-20A高效液相色譜儀，色譜柱：XSelect HSS T3 3.5 μm(2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：30 ℃；分析時(shí)間共5 min；流動相：0.01%甲酸水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫方式：0-0.1 min 5% B，0.1-0.5 min 5%-60% B，0.5-2.8 min 60% B，2.8-2.9 min 60%-5% B，2.9-5.0 min 5% B。

Tab 1 Collection ion pair,mass spectrometry parameters and retention time of tryptophan and kynurenine

1.4 溶液制備精密稱取色氨酸和犬尿氨酸適量，溶于甲醇，得到標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：色氨酸2 g·L-1，犬尿氨酸1 g·L-1。采用上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液制備8個(gè)梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液(色氨酸：200-40 000 μg·L-1，犬尿氨酸：3.75-750 μg·L-1)。質(zhì)量控制的樣本分別為色氨酸：400、4 000、20 000 μg·L-1，犬尿氨酸：7.5、75、375 μg·L-1。精密稱取適量的TRP-d5和KYN-d4，于甲醇中完全溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 g·L-1的儲備液；分別稀釋至1 000 μg·L-1，500 μg·L-1為混合內(nèi)標(biāo)工作液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取K2HPO4：1.42 g和KH2PO4：0.27 g均完全溶解于超純水，調(diào)節(jié)pH至7.4即為磷酸鹽緩沖液(KPI)，于4 ℃保存。精密稱取MgCI2、NADPH、FAD，用超純水溶解，分別配置成濃度為：60、40、1 mmol·L-1的溶液；Epacadostat(陽性藥物)和白藜蘆醇，采用甲醇：DMSO(V ∶V=10 ∶1)溶解，制成濃度為4 mmol·L-1的儲備液；上述溶液均于20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 體外肝微粒體孵育色氨酸代謝人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系總體積120 μL，包括KPI(pH 7.4)、MgCI2、人肝微粒體、NADPH、FAD、色氨酸，如Tab 2所示。將上述試劑加入反應(yīng)管中，37 ℃孵育90 min，孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至冰上，加入預(yù)冷的乙腈360 μL及40 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液終止反應(yīng)，充分震蕩渦旋4 min，20 ℃靜置10 min，12 000 r·min-1于4 ℃離心20 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.6 色氨酸在人肝微粒體中的酶動力

1.6.1最佳孵育時(shí)間優(yōu)化 將Tab 2中體系各個(gè)成分加入反應(yīng)管中，反應(yīng)時(shí)間分別為：0、30、60、90、120、180、270、360 min，各時(shí)間點(diǎn)平行3份。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)做一組不加色氨酸的對照組A(孵育體系中不包括色氨酸)，孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至冰上，之后同1.5項(xiàng)下操作。繪制時(shí)間-犬尿氨酸曲線(犬尿氨酸的生成量為實(shí)驗(yàn)組扣除每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對照組A)，選取最佳色氨酸孵育時(shí)間。

Tab 2 The metabolism system of tryptophan

1.6.2最佳肝微粒體蛋白濃度優(yōu)化 將色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中，其肝微粒體蛋白濃度分別為0、0.167、0.25、0.50、1.00、1.33、2.00、4.00 g·L-1，各個(gè)肝微粒體蛋白濃度平行3份，孵育時(shí)間為90 min(優(yōu)化后的最佳時(shí)間)。針對每個(gè)肝微粒體蛋白濃度同時(shí)做一組不加色氨酸的對照組A，孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至冰上，之后同1.5項(xiàng)下操作。繪制微粒體蛋白濃度-犬尿氨酸曲線(犬尿氨酸的生成量為實(shí)驗(yàn)組扣除每個(gè)肝微粒體蛋白濃度的對照組A)，選取最佳肝微粒體蛋白濃度。

1.6.3色氨酸在體外人肝微粒體中的酶動力參數(shù) 取不同濃度的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品工作液，加入肝微粒體蛋白濃度為1 g·L-1(經(jīng)過優(yōu)化的肝微粒體蛋白濃度)的孵育體系中，使得色氨酸的最終濃度分別為：0、2、4、6、8、10、16、20、40 mg·L-1，孵育90 min，各個(gè)色氨酸濃度平行3份。同時(shí)做一組不加色氨酸的對照組A，孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至冰上，之后同1.5項(xiàng)下操作。繪制色氨酸濃度-犬尿氨酸酶動力學(xué)曲線(犬尿氨酸的生成量為實(shí)驗(yàn)組扣除每個(gè)色氨酸濃度的對照組A)，計(jì)算酶動力學(xué)參數(shù)。

1.7 白藜蘆醇對人肝微粒體代謝色氨酸的影響將低、中、高3個(gè)濃度的Epacadostat(陽性對照組)和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(實(shí)驗(yàn)組)工作液，分別加入上述已優(yōu)化的人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中，使得藥物的終濃度為：2.5、20、50 μmol·L-1，各個(gè)濃度平行3份。同時(shí)孵育對照組B(人肝微粒體孵育色氨酸體系)和對照組C(藥物溶劑組)。孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至冰上，之后同1.5項(xiàng)下操作，分析犬尿氨酸生成量的變化。

1.8 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM Corporation，NY，USA)軟件進(jìn)行分析，采用ANOVA方法分析各組間差異。根據(jù)人肝微粒體的蛋白濃度和酶促反應(yīng)時(shí)間計(jì)算酶促反應(yīng)代謝物的生成速率；利用GraphPad Prism 7.04軟件，采用米氏方程V=(Vmax×S)/(Km+S)進(jìn)行非線性擬合，得到色氨酸在人肝微粒體的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS方法學(xué)

2.1.1方法專屬性和線性 結(jié)果顯示色氨酸、犬尿氨酸的保留時(shí)間分別為1.10、1.09 min，峰型良好(Fig 1)。在活性炭吸附已滅活的微粒體孵育體系中加入8個(gè)不同梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按照上述1.5項(xiàng)的處理方法，進(jìn)樣分析得到峰面積。用最小二乘法進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，待分析物的濃度為X軸，峰面積與內(nèi)標(biāo)的比值為Y軸。結(jié)果表明色氨酸(200-40 000 μg·L-1)，犬尿氨酸(3.75-750 μg·L-1)線性關(guān)系良好(r≥0.99)。

2.1.2精密度和準(zhǔn)確度 連續(xù)3 d檢測最低定量限、低、中、高不同濃度的質(zhì)控樣本。結(jié)果顯示色氨酸和犬尿氨酸日內(nèi)精密度的RSD分別為：3.26%-6.29%，3.58%-14.52%；日間精密度的RSD分別在6.40%-16.73%，4.44%-18.04%之間。肝微粒體孵育體系中色氨酸和犬尿氨酸精密度的RSD均在15%以內(nèi)，最低定量下限的精密度的RSD在20%范圍內(nèi)。最低定量限、低、中、高不同濃度的色氨酸和犬尿氨酸準(zhǔn)確度的RE均在15%以內(nèi)。均符合生物樣本檢測要求(Tab 3)。

2.1.3基質(zhì)效應(yīng)、回收率和穩(wěn)定性 該分析方法中測定肝微粒體孵育體系中色氨酸和犬尿氨酸的基質(zhì)效應(yīng)分別在(87.34±5.52)%-(93.91±2.61)%，(86.30±3.27)%-(92.30±3.85)%之間，均在15%以內(nèi)；因此樣品制備分析方法對待測物質(zhì)是有效的(Tab 3)。色氨酸和犬尿氨酸的回收率在(64.83±5.03)%-(80.21±3.67)%之間，RSD均小于15%(Tab 3)?？疾旄挝⒘ｓw孵育體系中低、高兩個(gè)濃度的色氨酸和犬尿氨酸質(zhì)控樣品在室溫、進(jìn)樣器放置4 h，24 h反復(fù)凍融3次，以及80 ℃放置15和30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示肝微粒體孵育體系中色氨酸和犬尿氨酸在不同條件下測得濃度偏差均在15%以內(nèi)，說明樣本在檢測過程中穩(wěn)定性良好(Tab 4)。

Fig 1 Chromatograms of tryptophan and kynurenine

Tab 3 Precision,accuracy,recovery and matrix effect for quantification of tryptophan and kynurenine

Tab 4 Stability of tryptophan and kynurenine in liver microsome incubation system

Fig 2 Effect of tryptophan incubation time and microsomal protein concentration on formation of kynurenine by human liver microsomes and enzyme kinetic parameters

Fig 3 Resveratrol and epacadosta inhibited human liver microsomal tryptophan metabolism to kynurenine

2.2 色氨酸體外代謝孵育最佳時(shí)間色氨酸與人肝微粒體在37 ℃孵育不同時(shí)間(0-360)min，考察代謝物犬尿氨酸的生成量和孵育時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果如Fig 2A所示，在0-120 min內(nèi)犬尿氨酸的生成量隨時(shí)間呈增長趨勢。120 min后犬尿氨酸的生成量逐漸趨于緩和。因此，最終選擇90 min為最佳孵育時(shí)間。

2.3 色氨酸體外代謝孵育的最佳肝微粒體蛋白濃度人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中肝微粒體蛋白終濃度在0-4 g·L-1范圍內(nèi)，考察代謝物犬尿氨酸的生成量和肝微粒體蛋白濃度的關(guān)系。如Fig 2B所示，犬尿氨酸的生成量與肝微粒體蛋白濃度在(0-1.33) g·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，隨后犬尿氨酸生成量逐漸趨于緩和。因此，蛋白濃度在(0-1.33) g·L-1范圍內(nèi)犬尿氨酸的生成速率最快，選擇該范圍內(nèi)的肝微粒體蛋白濃度為最佳濃度。

2.4 色氨酸在肝微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù)色氨酸在體外人肝微粒體中代謝生成犬尿氨酸，酶反應(yīng)速率常數(shù)Km為(95.91±22.29) μmol·L-1，最大反應(yīng)速率Vmax為(21.34±2.58) μmol·g-1·min-1；酶動力學(xué)曲線如Fig 2C所示。

2.5 白藜蘆醇以濃度依賴性抑制IDO活性在體外人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系分別加入低、中、高不同濃度的白藜蘆醇和Epacadostat。Epacadostat是已報(bào)道的IDO抑制劑，在本次研究做作為陽性藥物達(dá)到陽性對照目的；加入肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸生成減少，并且具有濃度依賴性(Fig 3A)。肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中加入白藜蘆醇也能夠抑制犬尿氨酸的生成；并且隨著白藜蘆醇濃度增加，犬尿氨酸的生產(chǎn)量隨之減少；20 μmol·L-1和50 μmol·L-1與對照組B和C比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig 3B)。這表明白藜蘆醇能夠以濃度依賴性抑制IDO的活性，減少犬尿氨酸的生成。

3 討論

本研究創(chuàng)建體外人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系及采用LC-MS/MS方法檢測肝微粒體孵育體系中色氨酸和犬尿氨酸。結(jié)果顯示白藜蘆醇通過抑制IDO的活性減少犬尿氨酸的生成，其抑制能力的強(qiáng)弱呈現(xiàn)濃度依賴性。利用LC-MS/MS方法檢測肝微粒體孵育體系中的色氨酸和犬尿氨酸水平，具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、精密度好、樣本分析過程中待測物質(zhì)穩(wěn)定、樣本處理簡單等優(yōu)點(diǎn)。

色氨酸是內(nèi)源性的化合物，肝微粒體孵育體系中可以檢測到色氨酸和犬尿氨酸。因此，實(shí)驗(yàn)過程中我們同時(shí)做一組不加色氨酸的對照組A，消除體系本身代謝產(chǎn)物的變化。采用活性炭吸附已滅活的肝微粒體孵育體系配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以消除微粒體中色氨酸和犬尿氨酸的干擾。色氨酸分解代謝生成犬尿氨酸這一途徑的關(guān)鍵酶是IDO，IDO是含亞鐵血紅素的雙加氧酶。在肝微粒體孵育色氨酸代謝體系建立的過程中也加入過亞鐵血紅素，但是沒有發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸生產(chǎn)量隨之增加。已有的IDO活性檢測體系中含有抗壞血酸[13]，在我們建立的肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中也加入抗壞血酸，但是未發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸的生成量增加。因此，在我們的人肝微粒體孵育色氨酸代謝體系中未加入抗壞血酸和亞鐵血紅素。本研究的LC-MS/MS檢測方法選用同位素標(biāo)記的色氨酸和犬尿氨酸作為內(nèi)標(biāo)，其與待檢測物質(zhì)有著相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，在一定程度上能夠降低分析過程中其他干擾物質(zhì)的影響，提高定量方法的準(zhǔn)確度。

正常生理?xiàng)l件下IDO表達(dá)水平較低，炎癥等疾病情況下IDO能夠被一些炎癥因子激活，如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)[14]。這些炎癥因子水平與IDO密切關(guān)聯(lián)。白藜蘆醇作為免疫調(diào)節(jié)劑的作用在各種動物模型和不同細(xì)胞系中都得到證實(shí)[15]。在嚙齒類動物中，白藜蘆醇可以減輕腹膜炎的炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體對癌細(xì)胞的免疫活性。在免疫系統(tǒng)中，白藜蘆醇可以激活沉默調(diào)控蛋白-1(sirtuin-1)抗炎途徑，降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)誘導(dǎo)的炎癥因子水平(如TNF-α、IL-6、IL-1β)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)。IFN-γ誘導(dǎo)BMDCs中IDO蛋白的表達(dá)，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后IDO表達(dá)量減少；白藜蘆醇治療的小鼠腫瘤生長受到抑制，腫瘤細(xì)胞中IDO表達(dá)量也降低[12]。另外，抑郁小鼠大腦皮層中IDO和TNF-α水平均上調(diào)，而給予白藜蘆醇灌胃處理后抑郁小鼠腦組織中IDO、IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白表達(dá)量均顯著降低[16]。上述研究結(jié)果表明白藜蘆醇能夠抑制機(jī)體炎癥因子的生成，并減少體內(nèi)IDO蛋白的表達(dá)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制人肝微粒體中色氨酸代謝生成犬尿氨酸，這表明IDO很可能是白藜蘆醇發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

色氨酸及其犬尿氨酸途徑的分解代謝物參與形成免疫抑制環(huán)境。IDO活性增加能夠激活犬尿氨酸途徑，使得犬尿氨酸的水平增加并加速色氨酸的消耗。犬尿氨酸生成增加可以激活芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)，抑制T細(xì)胞增殖。局部色氨酸耗竭能夠激活一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2，GCN2)和抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，從而誘導(dǎo)Tregs分化、抑制T細(xì)胞增殖，致使T細(xì)胞免疫功能下降[9]。犬尿氨酸途徑的代謝物如3-HAA和QA同樣被證實(shí)可直接誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞1(help T cell 1，Th1)凋亡，而對輔助性T細(xì)胞2(help T cell 2，Th2)無影響，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，促使腫瘤的發(fā)展[17]。IDO的小分子抑制劑1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan，1-MT)能夠抑制高表達(dá)IDO的腫瘤的生長[17]。因此，IDO主要通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝來介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。Noh等[12]研究表明，白藜蘆醇通過激活JAK/STAT1和PKCδ途徑調(diào)節(jié)IDO的免疫應(yīng)答過程?；谏鲜霰砻鱅DO介導(dǎo)的犬尿氨酸途徑在免疫抑制中具有重要作用；本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制人肝微粒體代謝生成犬尿氨酸，這提示白藜蘆醇在免疫抑制方面可能具有潛在作用，為白藜蘆醇應(yīng)用于藥物研發(fā)提供重要依據(jù)。

另一方面，IDO被激活引起犬尿氨酸途徑代謝增加與心血管疾病密切相關(guān)。犬尿氨酸可以誘導(dǎo)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS，在體內(nèi)外加速內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[7]。KYNA能以劑量依賴的方式降低心臟線粒體的呼吸參數(shù)，可能參與心肌病的進(jìn)程[18]。高脂飼料喂養(yǎng)小鼠后平滑肌細(xì)胞中IDO活性增加；而IDO缺乏可以抑制高脂飼料喂養(yǎng)的LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化形成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制IDO活性，減少犬尿氨酸的生成，這提示白藜蘆醇可能通過作用于IDO而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

總之，色氨酸及其犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物在免疫、心血管疾病等方面具有重要作用?；谌烁挝⒘ｓw孵育色氨酸代謝體系研究結(jié)果表明白藜蘆醇能夠抑制IDO活性，使色氨酸向犬尿氨酸途徑代謝減少，并且呈濃度依賴性。抑制IDO活性、調(diào)節(jié)色氨酸代謝可能是白藜蘆醇發(fā)揮多種藥理活性的機(jī)制之一。因此，白藜蘆醇作為潛在IDO抑制劑應(yīng)用與藥物開發(fā)研究具有重要意義。