桑輪紋病發(fā)生區(qū)桑葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在冠層內(nèi)的分異*

尹詩(shī)琳, 張建華, 李星月, 唐 甜, 王 謝**

桑輪紋病發(fā)生區(qū)桑葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在冠層內(nèi)的分異*

尹詩(shī)琳1,2, 張建華1,3, 李星月4, 唐 甜1, 王 謝1,3**

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 成都 610066; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 成都 611130; 3. 農(nóng)業(yè)部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610066; 4. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 成都 610066)

探明桑輪紋病發(fā)生區(qū)冠層內(nèi)葉表面微生物多樣性、結(jié)構(gòu)組成和功能的變化情況, 有助于快速篩選控制桑輪紋病病原菌()潛在的拮抗微生物。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù), 分析冠層上部和下部葉片上表面和下表面細(xì)菌相對(duì)豐度的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 1)在多樣性指數(shù)(Shannon)上, 冠層上部葉片是冠層下部葉片的1.26倍, 冠層內(nèi)葉片上表面是下表面的1.49倍。2)在結(jié)構(gòu)上, 冠層下部葉片的下表面(LB)和冠層上部葉片的下表面(UB)的優(yōu)勢(shì)屬均為泛菌屬(), 其相對(duì)豐度分別為38.04%和25.31%, 而冠層下部葉片的上表面(LS)為沙雷氏菌屬()、冠層上部葉片的上表面(US)為寡養(yǎng)單胞菌屬(), 其相對(duì)豐度分別為18.0%、23.73%。3)在功能上, 冠層下部葉片細(xì)菌的碳水化合物和氨基酸的運(yùn)輸和代謝功能比冠層上部葉片強(qiáng), 然而脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝功能比冠層上部葉片弱; 冠層上部葉片上表面細(xì)菌的細(xì)胞壁生物發(fā)生功能比下表面強(qiáng), 而氨基酸的運(yùn)輸和代謝功能弱于下表面; 冠層下部葉片上表面細(xì)菌的次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝和脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝功能強(qiáng)于下表面, 而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)比下表面弱。4)冠層內(nèi)葉片表面芽孢桿菌屬()、不粘柄菌屬()和苯基桿菌屬()的相對(duì)豐度與病原菌的相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)性顯著(<0.05), 相關(guān)性最大的為芽孢桿菌屬, 系數(shù)為?0.87。上述結(jié)果表明桑輪紋病發(fā)生區(qū)冠層內(nèi)桑葉上下表面細(xì)菌群落的多樣性、結(jié)構(gòu)組成和功能存在顯著差異, 對(duì)進(jìn)一步研究桑輪紋病的生物防控具有一定的科學(xué)意義。

桑輪紋病; 冠層部位; 多樣性指數(shù); 功能; 高通量測(cè)序

葉面微生物(phylloplane microorganism)是指直接以葉面作棲息生境的各種類型微生物, 包括細(xì)菌、真菌、病毒和原生生物等, 其中細(xì)菌的數(shù)量最為豐富, 可達(dá)106~107cells?cm?2(leaf)[1]。它們不僅受植物種類、海拔梯度[2]、生境條件[3]和季節(jié)差異[4]等因素影響, 還會(huì)受到植物葉片性質(zhì)的影響, 例如葉的生長(zhǎng)周期、葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉的化學(xué)組成和分泌物以及葉的空間位置等[5-6]。巨大山茱萸()冠層內(nèi)葉面微生物結(jié)構(gòu)受葉齡、葉層高度、葉層厚度以及距主干的距離等因素影響[7]; 柑橘黃龍病株(citrus huanglongbing)不同方位(東、西、南、北)葉片的細(xì)菌分布量也存在顯著差異[8]; 草莓(cv.Elsanta)在大田生長(zhǎng)條件下, 葉片表現(xiàn)為下部葉片的細(xì)菌數(shù)量要多于上部葉片, 而在溫室條件下上部葉片的細(xì)菌數(shù)量要多于下部葉片[9]。隨著葉面微生物研究的深入, 葉部病害發(fā)生與葉面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。紫莖澤蘭()健康葉和病葉的微生物物種組成和多樣性差異明顯, 健康葉比病葉顯示出更高的細(xì)菌多樣性, 健康和患病的葉面微生物群落之間的系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)有很大不同[10]; ‘金冠’蘋(píng)果()感染褐斑病的病葉和未感染褐斑病的健葉片的葉面微生物類群和相對(duì)出現(xiàn)頻率差別較大[11]; 南瓜白粉病[12]和茶白星病[13]在不同病情等級(jí)下的葉面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異。這些報(bào)道表明宿主植物的健康與微生物群落結(jié)構(gòu)、數(shù)量和多樣性密切相關(guān)。桑樹(shù)()的桑輪紋病在中國(guó)、日本、美國(guó)、印度等熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)頻發(fā), 影響了世界蠶業(yè)的發(fā)展。我國(guó)臺(tái)灣[14]、云南昭通[15]、江西修水[16]、浙江淳安[17]、廣西百色[18]和四川眉山等地方對(duì)該病害的發(fā)病規(guī)律及特征進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道, 調(diào)查發(fā)現(xiàn), 病原菌桑膝節(jié)霉[19]()著生在桑葉的下表面, 冠層下部的葉片發(fā)病最為嚴(yán)重, 病斑較多且大, 冠層上部葉片發(fā)病較輕或者無(wú)發(fā)病, 病斑較少而小[20]。針對(duì)這一現(xiàn)象, 本研究提出了“桑輪紋病發(fā)生時(shí)冠層內(nèi)桑葉的葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 并且桑葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)冠層內(nèi)垂直空間的響應(yīng)存在顯著差異”的假設(shè)。為論證這一假設(shè), 并同時(shí)挖掘潛在的病原菌的拮抗細(xì)菌, 本研究以桑輪紋病株不同冠層高度的葉片為研究對(duì)象, 利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)冠層下部葉片的下表面(LB)和上表面(LS)、冠層上部葉片的下表面(UB)和上表面(US)的微生物16S rDNA的V3-V4區(qū)和ITS rDNA的ITS1-2區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析, 揭示微生物群落結(jié)構(gòu)、功能和多樣性在上下冠層葉片上下表面的差異, 對(duì)快速篩選控制桑輪紋病病原菌()潛在的拮抗微生物有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

采樣時(shí)間為2018年9月31日, 采樣地點(diǎn)在四川省眉山市青神縣黃桷村桑園(103°41￠29″~ 103°59￠31″E、29°42￠30″~29°55￠33″N), 海拔高度349 m。桑樹(shù)品種為‘湘7920’。桑園占地面積約20 000 m2(200 m′100 m), 劃分為4個(gè)面積大致相等的樣地(100 m′50 m)。每個(gè)樣地選取10株發(fā)病桑樹(shù), 用經(jīng)酒精消毒后的剪刀分別在每株樹(shù)冠層的上部(距離地表1.3 m以上)和下部(距離地表0.6~1.3 m)的東、南、西、北、中各方位各取1片, 每張葉片單獨(dú)裝于無(wú)菌取樣袋中, 總計(jì)100張桑葉。上部葉片的發(fā)病程度大致為無(wú)病斑或1個(gè)病斑左右, 病斑面積占整個(gè)葉面積的0~10%; 下部葉片的發(fā)病程度大致為3個(gè)病斑以上, 病斑面積占整個(gè)葉面積的11%~40%。將樣本放入低溫保藏箱, 并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室, 置于4 ℃的冰箱中保存、備用。

在超凈工作臺(tái)上, 棉球浸泡1%次氯酸鈉溶液后均勻擦拭葉片上表面, 用無(wú)菌水均勻擦拭葉片上表面, 再棉球浸泡于75%乙醇中后均勻擦拭葉片上表面, 以上操作重復(fù)3次。按上述方式消毒處理后, 置于無(wú)菌均質(zhì)袋中, 該處理后的樣品用于檢測(cè)葉片下表面細(xì)菌群落, 命名為: 冠層下部葉片的下表面(LB)和冠層上部葉片的下表面(UB)。按照上述方法處理葉片的下表面, 該處理后的樣品用于檢測(cè)葉片上表面細(xì)菌群落, 命名為: 冠層下部葉片的上表面(LS)和冠層上部葉片的上表面(US)。

1.2 樣本DNA提取、擴(kuò)增及純化

參考羅路云等[12]方法收集桑葉葉片表面的微生物, 再按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA kit試劑盒(http://omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/)的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以樣品DNA為模板, 選用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物341F和805R[21]和真菌ITSrDNA基因的通用引物ITS1和ITS2-Rev[22]進(jìn)行第1次擴(kuò)增, 引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增, 最后利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒回收產(chǎn)物。高通量測(cè)序所使用的引物如表1所示。

表1 高通量測(cè)序使用的引物

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

1.3.1 測(cè)序序列信息分析

用CASAVA堿基識(shí)別分析將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(raw reads)。首先用Cutadapt (v.1.2.1)軟件去除3￠端測(cè)序引物接頭, 再用PEAR[23](v.0.9.6)軟件將成對(duì)reads拼接成一條序列, 然后用barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù), 最后利用Prinseq[24](v.0.20.4)軟件對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切, 得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)。利用Usearch[25](v.5.2.236)軟件去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列, 得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(filtered reads)。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析

聚類分析: 用Usearch[25](v.5.2.236)軟件在97%的相似水平下將各樣本的有效序列聚類成為可操作分類單元OTUs(operational taxonomic units), 然后根據(jù)各樣本OTU豐度計(jì)算beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類(hierarchical clustering)分析, 再使用非加權(quán)組平均法UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)。

多樣性指數(shù)分析: 使用97%相似度的OTU, 利用Mothur軟件[26](v.1.30.1)做rarefaction分析和計(jì)算各樣本的多樣性指數(shù)(Chao1、ACE、Shannon和Simpson), 然后用SPSS (v.24.0)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較(LSD)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較分析(=0.05), 圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)。

物種分類分析: 用RDP classifier[27](v.2.12)軟件的Na?ve Bayesian assignment算法將樣本進(jìn)行物種分類, 依次為門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個(gè)層次進(jìn)行物種分類?；赟TAMP (v.2.1.3)[28]功能物種分類結(jié)果和PICRUST[29]功能2級(jí)分類結(jié)果, 比較樣本或組間豐度差異, 找出樣本或組間豐度存在顯著差異的物種分類和功能分類, 默認(rèn)篩選條件為<0.05。

相關(guān)性分析: 用SPSS (v.24.0)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 采用雙變量相關(guān)分析[12](bivariate correlation)法求出相關(guān)系數(shù)值并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序序列長(zhǎng)度分析

由測(cè)序序列長(zhǎng)度結(jié)果(表2)可見(jiàn), 所有樣本共測(cè)得原始測(cè)序序列948 283條, 有效序列871 232條。為了保證信息分析質(zhì)量, 去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列得高質(zhì)量序列853 053條, 平均序列長(zhǎng)度420.42 bp。

表2 不同冠層位置桑葉葉片上下表面細(xì)菌序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)表

2.2 OTU豐度的樣本聚類分析

由圖1可見(jiàn), 所有樣本共檢測(cè)到1054 OTUs。重合的細(xì)菌OTUs 29個(gè), 占總數(shù)的2.75%; LB、LS、UB和US葉片表面特異的細(xì)菌OTUs分別為275、210、349和307, 分別占其豐度的24.00%、17.66%、31.22%和27.12%。共有OTUs較少, 獨(dú)有OTUs較多, 表明各樣本間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大?；贠TU豐度對(duì)所有樣本進(jìn)行聚類分析(圖1)顯示: LS和US聚為一類, LB和UB聚為一類, 表明冠層內(nèi)上表面和下表面之間的差異顯著高于冠層上部和冠層下部之間的差異。

LB: 冠層下部葉片的下表面; LS: 冠層下部葉片的上表面; UB: 冠層上部葉片的下表面; US: 冠層上部葉片的上表面。LB: lower surface of leaf from lower canopy; LS: upper surface of leaf from lower canopy; UB: lower surface of leaf from upper canopy; US: upper surface of leaf from upper canopy.

2.3 多樣性指數(shù)分析

對(duì)各樣本的細(xì)菌群落進(jìn)行豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))和均勻度指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))分析(表3), Chao1指數(shù)表現(xiàn)為UB>LB>LS>US, 各樣本間的差異不顯著; ACE指數(shù)表現(xiàn)為L(zhǎng)B>UB>LS>US, LB和US之間的差異顯著; Shannon指數(shù)表現(xiàn)為US>LS>UB>LB, LB與LS、UB和US都差異顯著; Simpson指數(shù)表現(xiàn)為L(zhǎng)B>UB>LS>US, US與UB和LB差異顯著。冠層上部葉片和下部葉片的均勻度指數(shù)(Shannon)差異顯著, 冠層上部葉片是冠層下部葉片的1.26倍。葉片上表面的均勻度指數(shù)(Shannon)差異顯著, 上表面是下表面的1.49倍。數(shù)據(jù)表明: 冠層上部葉片細(xì)菌分布均勻度高于冠層下部, 葉片上表面的細(xì)菌分布均勻度高于下表面。

2.4 物種分類水平上的細(xì)菌群落組分分析

所有樣本檢測(cè)出的細(xì)菌分屬于35個(gè)門、61個(gè)綱、90個(gè)目、190個(gè)科和555個(gè)屬。從各分類水平上物種相對(duì)豐度表(表4)可知, 在門和綱水平上, 各樣本的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria, 89.06%)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria, 72.69%)。變形菌門在LB、LS、UB和US中所占比例分別為99.29%、88.04%、91.22%和78.52%; γ-變形菌綱在LB、LS、UB和US中所占比例分別為94.99%、67.53%、77.77%和52.82%。在目水平上, 腸桿菌目(Enterobacteriales, 45.39%)是LB、LS和UB的優(yōu)勢(shì)菌目, 其相對(duì)豐度在各樣本中所占比例分別為84.10%、43.80%和48.65%; 黃色單胞桿菌目(Xanthomonadales, 13.82%)是US的優(yōu)勢(shì)菌目, 相對(duì)豐度在樣本中所占比例為24.62%。在屬水平上, 泛菌屬(, 19.70%)是LB和UB的優(yōu)勢(shì)菌屬, 其相對(duì)豐度在各樣本中所占比例分別為38.04%和25.31%; 寡養(yǎng)單胞菌屬(, 12.53%)是US的優(yōu)勢(shì)菌屬, 其相對(duì)豐度在樣本中所占比例為23.73%; 沙雷氏菌屬(, 8.79%)是LS的優(yōu)勢(shì)菌, 其相對(duì)豐度在樣本中所占比例為18.00%。

表3 不同冠層位置桑葉葉片上下表面細(xì)菌群落豐富度和多樣性

LB: 冠層下部葉片的下表面; LS: 冠層下部葉片的上表面; UB: 冠層上部葉片的下表面; US: 冠層上部葉片的上表面。表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(<0.05)。LB: lower surface of leaf from lower canopy; LS: upper surface of leaf from lower canopy; UB: lower surface of leaf from upper canopy; US: upper surface of leaf from upper canopy. The values in the table are mean±SD. Different lowercase letters in a column indicate significant differences at<0.05 level.

表4 不同冠層位置桑葉葉片上下表面細(xì)菌各分類水平上數(shù)量排名前10物種相對(duì)豐度在各樣本中所占比例

續(xù)表4

LB: 冠層下部葉片的下表面; LS: 冠層下部葉片的上表面; UB: 冠層上部葉片的下表面; US: 冠層上部葉片的上表面。LB: lower surface of leaf from lower canopy; LS: upper surface of leaf from lower canopy; UB: lower surface of leaf from upper canopy; US: upper surface of leaf from upper canopy.

2.5 各樣本豐度存在顯著差異的物種分類和功能預(yù)測(cè)

2.5.1 屬水平樣本間菌群豐度差異

從屬水平上兩兩間豐度存在顯著差異的物種分類可見(jiàn)表5。在冠層下部, 上表面和下表面存在顯著差異的物種有勒克氏菌屬()、薄層菌屬()、金黃桿菌屬()和地嗜皮菌屬(), 上表面所占比例分別為9.10%、93.33%、99.20%和93.83%, 下表面所占比例分別為90.90%、6.67%、0.80%和6.17%。在冠層上部, 上表面和下表面存在顯著差異的物種有鞘氨醇單胞菌屬()、異常球菌屬()和勒克氏菌屬, 上表面所占比例分別為79.76%、82.00%和0, 下表面所占比例分別為20.24%、18.00%和100.00%。可知, 上表面的薄層菌屬、金黃桿菌屬、地嗜皮菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和異常球菌屬的豐度都顯著高于下表面, 然而勒克氏菌屬的豐度顯著低于下表面。無(wú)論是在冠層上部還是在冠層下部, 下表面的勒克氏菌屬豐度顯著高于上表面, 上表面和下表面所占比例分別為5.00%和95.00%。在屬分類水平上數(shù)量排名前10物種中, 冠層上部葉片上表面和下表面存在顯著差異的菌屬是鞘氨醇單胞菌屬, 冠層下部葉片上表面和下表面存在顯著差異的菌屬是金黃桿菌屬, 這兩個(gè)菌屬都表現(xiàn)為上表面的豐度大于下表面。

表5 不同冠層位置桑葉葉片上下表面兩兩間細(xì)菌豐度存在顯著差異(P<0.05)的屬

LB: 冠層下部葉片的下表面; LS: 冠層下部葉片的上表面; UB: 冠層上部葉片的下表面; US: 冠層上部葉片的上表面。LB: lower surface of leaf from lower canopy; LS: upper surface of leaf from lower canopy; UB: lower surface of leaf from upper canopy; US: upper surface of leaf from upper canopy.

2.5.2 功能豐度差異分析

首先對(duì)已有測(cè)序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成進(jìn)行分析, 然后通過(guò)16S測(cè)序獲得的物種構(gòu)成推測(cè)樣本中功能基因的構(gòu)成, 從而分析不同樣本和分組之間在功能上的差異(表6), 默認(rèn)篩選條件為<0.05。從兩兩樣品間豐度存在差異的功能分類可知, 在冠層下部, 上表面次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝以及脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝功能比下表面強(qiáng),然而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)比下表面弱; 在冠層上部, 上表面的細(xì)胞壁生物發(fā)生功能比下表面強(qiáng), 然而氨基酸的運(yùn)輸和代謝功能比下表面弱。冠層下部細(xì)菌菌群的碳水化合物和氨基酸的運(yùn)輸和代謝基因功能比冠層上部強(qiáng), 然而脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝基因功能比冠層上部弱。

表6 不同冠層位置桑葉葉片上下表面兩兩間豐度存在顯著差異(P<0.05)的細(xì)菌功能分類

LB: 冠層下部葉片的下表面; LS: 冠層下部葉片的上表面; UB: 冠層上部葉片的下表面; US: 冠層上部葉片的上表面。LB: lower surface of leaf from lower canopy; LS: upper surface of leaf from lower canopy; UB: lower surface of leaf from upper canopy; US: upper surface of leaf from upper canopy.

2.6 桑輪紋病菌與菌群多樣性和組成的關(guān)系

冠層下部葉片的下表面(LB)和上表面(LS)、冠層上部葉片的下表面(UB)和上表面(US)屬的相對(duì)豐度分別為5.76%和0.84%、0.57%和0.54%, 與在屬水平上排名前100細(xì)菌菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析, 相關(guān)性顯著(<0.05)的菌屬是芽孢桿菌屬()、不粘柄菌屬()和苯基桿菌屬(), 相關(guān)系數(shù)分別為?0.87、?0.84和?0.79。冠層下部葉片的下表面(LB)和上表面(LS)、冠層上部葉片的下表面(UB)和上表面(US)屬的多樣性指數(shù)與細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析, 結(jié)果表明, 病原菌與細(xì)菌群落的均勻度指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))有一定的相關(guān)性, 相關(guān)系數(shù)分別為?0.31和0.21, 但是相關(guān)性不顯著; 病原菌與細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)(ACE指數(shù)和Chao1指數(shù))基本不相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為0.03和0.13。

3 討論

3.1 桑葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在冠層內(nèi)垂直空間的分異

群落的均勻度反映群落的穩(wěn)定性和生境特性, 均勻度指數(shù)越高群落物種多樣性就越高, 群落越穩(wěn)定, 生境越適于群落生存[30-31]。冠層上部葉片和冠層下部葉片的均勻度指數(shù)(Shannon)差異顯著, 冠層上部葉片是冠層下部葉片的1.26倍。這種差異可能與葉片發(fā)病程度和周期的差異有關(guān), 冠層上部葉片發(fā)病較輕或者無(wú)發(fā)病, 病斑較少而小, 處于發(fā)病的前期; 冠層下部葉片發(fā)病最為嚴(yán)重, 病斑較多且大, 處于發(fā)病的中期。葉片從發(fā)病前期到中期, 其細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為逐漸下降的趨勢(shì)。羅路云等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同南瓜白粉病病情等級(jí)下細(xì)菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)都存在差異, 隨著病情等級(jí)的提高多樣性呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。另一方面可能由生境差異造成, 冠層上部光照強(qiáng)溫度高, 通風(fēng)透光; 然而冠層下部光照弱溫度低, 通風(fēng)透光差, 相對(duì)濕度較高, 冠層上部的生境更利于大多數(shù)細(xì)菌的生存。在屬分類水平上數(shù)量排名前10物種中, 冠層下部葉片下表面(LB)和冠層上部葉片下表面(UB)細(xì)菌相對(duì)豐度存在顯著差異的菌屬是鞘氨醇單胞菌屬, UB的相對(duì)豐度是LB的2.44倍。鞘氨醇單胞菌屬具有耐受極端貧營(yíng)養(yǎng)條件、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)和降解多種有機(jī)污染物[32][如氯化外源性物質(zhì), 二惡因和多環(huán)芳烴(PAHs)]的特征[33]。該菌可有效地抵抗多種植物病原菌, 比如對(duì)引起黃萎病的真菌大麗輪枝功()有拮抗作用[34]; 對(duì)水稻病原體的感染起到有效的抵抗作用[35], 從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。冠層上部葉片的鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度較高, 而上部葉片發(fā)病程度較輕或者無(wú)發(fā)病, 這可能是因?yàn)榍拾贝紗伟鷮僭鰪?qiáng)了桑葉的抗病性。

3.2 桑葉上表面和下表面細(xì)菌菌群的分異

桑葉葉片上表面和下表面的細(xì)菌均勻度指數(shù)(Shannon)差異顯著, 上表面是下表面的1.49倍。這可能與病原菌菌絲著生在葉片的位置有關(guān), 當(dāng)病原菌定殖在葉片下表面后, 微生物之間對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)加劇, 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)是葉際微生物之間重要的相互關(guān)系[36], 從而影響微生物的多樣性。在屬分類水平上數(shù)量排名前10物種中, 冠層上部葉片上表面和下表面存在顯著差異的菌屬是鞘氨醇單胞菌屬, 冠層下部葉片上表面和下表面存在顯著差異的菌屬是金黃桿菌屬, 這兩個(gè)菌屬都表現(xiàn)為上表面的豐度大于下表面。鞘氨醇單胞菌屬和金黃桿菌屬均為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌, 無(wú)芽胞, 菌落為黃色, 接觸酶陽(yáng)性, 專性需氧。這可能與生境差異有關(guān), 上表面的氧氣含量更高, 需氧細(xì)菌的相對(duì)豐度就越大。

3.3 泛菌屬(Pantoea)可能對(duì)桑輪紋病的發(fā)生有協(xié)同或者伴生作用

本研究對(duì)桑輪紋病發(fā)生區(qū)冠層上部和下部葉片上表面和下表面細(xì)菌菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行分析, 結(jié)果表明葉片表面的優(yōu)勢(shì)屬是泛菌屬。冠層下部葉片的下表面(LB)和上表面(LS)、冠層上部葉片的下表面(UB)和上表面(US)泛菌屬的相對(duì)豐度分別為38.04%和13.86%、25.31%和7.69%, 病原菌()的相對(duì)豐度分別為5.76%和0.84%、0.57%和0.54%, 泛菌屬與病原菌屬呈正相關(guān)關(guān)系。泛菌屬是革蘭陰性粗短桿菌, 也是一種腐生菌或植物病斑上的次生菌[37], 廣泛存在于植物表面, 會(huì)引起植物腐爛。國(guó)內(nèi)外研究表明, 泛菌屬細(xì)菌會(huì)引起很多植物病害的發(fā)生, 例如菠蘿泛菌()和分散泛菌()是玉米新型細(xì)菌性褐腐病[38]、加州高粱葉斑病[39]的病原物; 成團(tuán)泛菌()引起玉米葉疫病和維管束枯萎病[40]、玉米細(xì)菌干莖腐病[41]、棉花細(xì)菌性爛鈴病[42]和香蕉葉鞘腐敗病[43]等病害。泛菌屬的部分菌株還是桑樹(shù)病害的條件致病菌, 例如桑葉穿孔病的病葉葉面分離到成團(tuán)泛菌和菠蘿泛菌[44]; ?？菸〉牟≡鷮儆谀c桿菌科的腸桿菌屬()、克雷白氏桿菌屬()和泛菌屬[45]。泛菌屬可能對(duì)桑輪紋病的發(fā)生有協(xié)同或者伴生作用, 但它是否為桑輪紋病的條件致病菌, 仍需進(jìn)一步的研究。

3.4 芽孢桿菌屬(Bacillus)可能對(duì)病原菌存在著某種程度的拮抗作用

病原菌的相對(duì)豐度與在屬分類水平上排名前100細(xì)菌菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 相關(guān)性最大的菌屬是芽孢桿菌, 相關(guān)系數(shù)為?0.87。在葉片發(fā)病的時(shí)候, 相應(yīng)的協(xié)同發(fā)病菌種數(shù)量增加, 拮抗菌種的數(shù)量可能降低, 推測(cè)該菌屬可能對(duì)病原菌存在著某種程度的拮抗作用。芽孢桿菌是好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生抗逆性芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌, 也是桑樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群[46], 廣泛分布于水體、土壤、空氣和動(dòng)物腸道等。它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排阻[47]、誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性[48]和拮抗作用等機(jī)制抑制植物病原菌生長(zhǎng), 提高宿主植物的抗病抗逆能力[49]來(lái)促進(jìn)植物自身的生長(zhǎng)。其中, 拮抗作用主要是通過(guò)生成抑菌活性物質(zhì)[50]來(lái)抑制植物病害, 生防芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)包括脂肽類化合物和聚酮類化合物[51]。近幾年從桑樹(shù)的葉、莖和果實(shí)分離到的芽孢桿菌屬的部分菌株對(duì)桑青枯病、桑疫病、桑椹菌核病、桑斷枝爛葉病的病原菌都有一定的拮抗作用。從健康桑葉中分離到的多粘芽孢桿菌()對(duì)桑青枯病菌和桑疫病菌有一定的抑菌效果[52]。從健康植株的莖中分離到的特基拉芽孢桿菌()[53]和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌()[54]對(duì)桑椹菌核病有很強(qiáng)的抑菌作用, 貝萊斯芽孢桿菌()對(duì)桑斷枝爛葉病菌抑菌作用穩(wěn)定且顯著[51]。從健康桑椹果中分離到的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)桑椹菌核病有很強(qiáng)的抑菌作用[55]。本文利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到芽孢桿菌屬與病原菌存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 所以可以嘗試從芽孢桿菌屬中篩選出用于桑輪紋病害生物防治的菌株, 芽孢桿菌屬對(duì)桑輪紋病的抑制效果還需要進(jìn)一步研究。高通量測(cè)序具有高效率、高速和成本低的優(yōu)勢(shì), 但是該方法受樣品采集和處理過(guò)程的差異、擴(kuò)增引物對(duì)不同細(xì)菌擴(kuò)增的偏好性[56]、分析方法局限性等因素的限制, 無(wú)法精確地反映樣品中實(shí)際的菌群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

桑輪紋病發(fā)生區(qū)冠層上部和下部葉片上表面和下表面細(xì)菌多樣性、結(jié)構(gòu)組成和功能存在差異。在多樣性上, 冠層上部葉片細(xì)菌分布均勻度高于冠層下部, 冠層內(nèi)葉片上表面的細(xì)菌分布均勻度高于下表面。在結(jié)構(gòu)組成上, 冠層上部葉片的上表面(US)和下表面(UB)的優(yōu)勢(shì)菌群分別為寡養(yǎng)單胞菌屬()和泛菌屬(); 冠層下部葉片的上表面(LS)和下表面(LB)的優(yōu)勢(shì)菌群分別為沙雷氏菌屬()和泛菌屬。在功能預(yù)測(cè)上, 細(xì)菌群落的運(yùn)輸和代謝潛力有明顯差異, 包含碳水化合物、次生代謝物、氨基酸和脂質(zhì)。在相關(guān)性上, 冠層內(nèi)葉片表面菌屬芽孢桿菌屬、不粘柄菌屬和苯基桿菌屬的相對(duì)豐度與病原菌的相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)性顯著, 相關(guān)性最大的為芽孢桿菌屬, 系數(shù)為?0.87。

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Differentiation in the bacterial community structure of mulberry leaf surfaces in the canopy where mulberry ring rot disease occurs*

YIN Shilin1,2, ZHANG Jianhua1,3, LI Xingyue4, TANG Tian1, WANG Xie1,3**

(1. Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China; 2. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 3. Key Laboratory of Southwest Mountain Agricultural Environment of the Ministry of Agriculture, Chengdu 610066, China; 4. Institute of Plant Protection, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

To identify the antagonistic bacteria of, this study investigated variations in the diversity, structure, and function of phylloplane microorganisms in the mulberry ring rot disease areas of mulberry canopy. Using high-throughput sequencing technology, we analyzed the relative abundance of bacteria on the upper and lower surfaces of the upper and lower leaves in the canopy. The results showed that 1) the Shannon index in upper canopy was 1.26 times of that in the lower canopy, and the upper surface of leaves was 1.49 times of that in the lower surface. 2) The dominant genera in the lower surface of a leaf in the lower canopy (LB) and the lower surface of a leaf in the upper canopy (UB) were the genus, with relative abundances of 38.04% and 25.31%, respectively. In the upper surface of a leaf in the lower canopy (LS), it wasand the upper surface of a leaf in the upper canopy (US) was, with relative abundances of 18.0% and 23.73%, respectively. 3) The transport and metabolism of carbohydrates and amino acids of bacteria in the lower canopy leaves were stronger than those in the upper canopy leaves; however, lipid metabolism and transport were weaker in the lower canopy leaves. The cell wall biogenesis function of bacteria on the upper surface of leaf in upper canopy was stronger than that on the lower surface, whereas the amino acid transport and metabolism functions were weaker on the upper surface. The biosynthesis, transport, and catabolism of secondary metabolites, lipid transport, and the metabolism of bacteria on the upper surface of lower canopy leaves were stronger than those on the lower surface, but cell movement was weaker on the upper surface. The relative abundances of,, andwere significantly negatively related to the relative abundance of pathogens (<0.05); the most significant correlation was for(?0.87). These results indicate significant differences in the diversity, structure, and function of bacterial communities on the upper and lower surfaces of mulberry leaves in the canopy, which will assist further research on the biological control of mulberry ring rot disease.

Mulberryring rot; Canopy part; Diversity index; Function; High-throughput sequencing

10.13930/j.cnki.cjea.200542

尹詩(shī)琳, 張建華, 李星月, 唐甜, 王謝. 桑輪紋病發(fā)生區(qū)桑葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在冠層內(nèi)的分異[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(中英文), 2021, 29(3): 520-530

YIN S L, ZHANG J H, LI X Y, TANG T, WANG X. Differentiation in the bacterial community structure of mulberry leaf surfaces in the canopy where mulberry ring rot disease occurs[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2021, 29(3): 520-530

S888.71

* 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-18)資助

王謝, 主要研究方向?yàn)樯?shù)的土壤-植物-微生物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能。E-mail: wangxiechangde@hotmail.com

尹詩(shī)琳, 主要研究方向?yàn)樯@土壤微生物多樣性與病蟲(chóng)害生物防治。E-mail: yinshilin6793@163.com

2020-07-06

2020-09-15

* This study was supported by the Special Fund for the Industrial System Construction of Modern Agriculture of China (CARS-18).

, E-mail: wangxiechangde@hotmail.com

Jul. 6, 2020;

Sep. 15, 2020