瀉痢康腸溶膠囊微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)研究

孫曉朋，曹 瑩，王 萌

鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，河南 鄭州 450000

瀉痢康腸溶膠囊是療效非常好的一味醫(yī)院制劑。其含有五倍子、麩煨肉豆蔻、白鮮皮、枯礬、大蒜和醋艾炭這六味中藥飲片。其中的五倍子有抗菌解毒等多種生物學(xué)功能［1-2］。 白鮮皮對廣譜的真菌有抑制作用［3-4］?？莸\對大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌等都有明顯的抑菌作用［5］。大蒜是天然的植物廣譜抗菌素［6］，大蒜素的殺菌能力是青霉素的十分之一［7］，對多種細(xì)菌、真菌均有抑制和殺滅作用，是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的天然植物中抗菌作用最強(qiáng)的一種［8］。綜上所述，瀉痢康腸溶膠囊的抑菌性非常強(qiáng)。《中國藥典》2015年版四部規(guī)定，應(yīng)先消除供試品的抑菌活性，才能依法檢查。因此本文依據(jù)四部通則1105、1106、1107具體規(guī)則作為檢測依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)臋z查方法，建立該藥的微生物限度的檢查方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）選擇儀器：超凈工作臺（JB-CJ-2FC 蘇州佳寶凈化），生物安全柜（LA2-4A1 新加坡藝思高），電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH-B11 500BS 上海躍進(jìn)）、霉菌培養(yǎng)箱（MJP-250上海精宏），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160上海精宏），蒸汽滅菌器（SX-700，日本TOMMY公司）。（2）試藥：瀉痢康腸溶膠囊，規(guī)格：每粒裝0.4 g，批號：190402、190421、190422。（3）適用性檢查用培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：20190515）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：20190103）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號：20190305）、麥康凱液體培養(yǎng)基(Mac，批號：20190226）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacA，批號：20190123）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE，批號：20190218）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBA，批號：20190105）、RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基（RV，批號：20190312）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD，批號：20190301）以上均購于青島海博。（4）菌種：金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10 104〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63 501〕、白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕、 黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕、大腸埃希菌〔CMCC（B）44 102〕，乙型副傷寒沙門菌〔CMCC（B）50094〕，以上均購于中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代次數(shù)均為3代。

1.2 方法

（1）菌液制備： 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至100 ml TSB 中，33℃培養(yǎng)20 h，并稀釋成濃度適宜的菌懸液。 接種枯草芽孢桿菌的TSA 斜面培養(yǎng)物至盛有TSA 的茄形培養(yǎng)瓶內(nèi)，在斜面上均勻涂布，33℃培養(yǎng)7 日，用滅菌水100 ml 分次將芽孢洗下，65℃水浴中加熱30 min，并稀釋成濃度適宜的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至100 ml SDB 中，25℃培養(yǎng)48 h，并稀釋成濃度適宜的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA上，23℃培養(yǎng)7天，用0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫制成適宜濃度的菌懸液。（2）計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)（回收試驗(yàn)）：供試品溶液的制備：取供試品10 g，加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖溶液至100 ml，置45℃水浴中，搖勻，即為1:10 的溶液，同時(shí)制備1：100，1：1000的供試品溶液。試驗(yàn)組（供試品溶液＋菌液）：需氧菌計(jì)數(shù)（供試品溶液稀釋法）：取1∶1000的供試品溶液9.9 ml、5 份，分別加入各試驗(yàn)菌液0.1 ml，混勻，使1.0 ml 供試品溶液中含菌量不大于100 cfu。分別取3.0 ml加菌后的供試品溶液，等量分注3個(gè)平皿內(nèi)，傾注TSA，培養(yǎng)。 霉菌及酵母菌檢查（供試品溶液稀釋法）：取1∶100供試品溶液9.9 ml、2份，分別加入各試驗(yàn)菌液0.1 ml，使1.0 ml 供試品溶液中含菌量不大于100 cfu。分別取3.0ml 加菌后的供試品溶液，等量分注3 個(gè)平皿內(nèi)，傾注SDA，培養(yǎng)。供試品對照組（測供試品本底菌數(shù)）：取1:1000、1:100的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。菌液對照組（測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)）；取各菌懸液0.1 ml，分別注入平皿中，每種試驗(yàn)菌平行制備3個(gè)平皿。

2 結(jié)果

由表1 看出，需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)與霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法中試驗(yàn)菌種的回收比值均在0.5～2.0的范圍內(nèi)。

表1 需氧菌、霉菌及酵母菌回收率測定結(jié)果

2.1 控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

供試品溶液制備；取計(jì)數(shù)方法適用性項(xiàng)下制備的1:10溶液，用于控制菌檢查方法適用性的驗(yàn)證。

2.2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

（1）增菌培養(yǎng)： 取1:10的供試品溶液10 ml及大腸埃希菌菌液（不大于100 cfu），加入100 ml TSB 中，培養(yǎng)18 h。（2）選擇和分離培養(yǎng)：取上述TSB 培養(yǎng)液1 ml，接種至100 mlMac 中，43℃培養(yǎng)24 h。取Mac 培養(yǎng)物劃線接種于MacA上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察，見表2。

表2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

（1）預(yù)培養(yǎng)： 取供試品10 g，加TSB 至100 ml，搖勻，在22℃培養(yǎng)2 小時(shí)。（2）選擇和分離培養(yǎng)：取1:10 的供試品溶液預(yù)培養(yǎng)液2 ml，分別接種至2 支15 ml 的EE 中，其中一支加入大腸埃希菌菌懸液（不大于100 cfu），另一支加入銅綠假單胞菌菌懸液（不大于100 cfu），33℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)液分別劃線接種于VRBA 上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察，見表3。

表3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

（1）增菌培養(yǎng)：取供試品10 g 及乙型副傷寒沙門菌菌液（ 不大于100 cfu），加入200 ml TSB 中，培養(yǎng)18 h。（2）選擇和分離培養(yǎng)；取上述TSB 培養(yǎng)液0.1 ml，接種至10 mlRV中，33℃培養(yǎng)18 h。取少量RV培養(yǎng)物劃線接種于XLD上，33℃培養(yǎng)18 h，觀察，見表4。

表4 沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

該藥主要由植物的根、皮、動(dòng)物及礦物組成，本來微生物污染情況就不容易控制，同時(shí)又因?yàn)樵撍幹泻形灞蹲?、白鮮皮、枯礬、大蒜等這些抑菌性很強(qiáng)的中藥飲片，而微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)需要在藥物抑菌作用盡可能被降低或者說是達(dá)到無抑菌的條件下進(jìn)行，這給試驗(yàn)帶來很大困難。當(dāng)然采用薄膜過濾法是比較經(jīng)典的去除抑菌性的一個(gè)非常有效的方法，但是我們此次試驗(yàn)的對象是中成藥，無法像化學(xué)藥一樣在合適的稀釋液中溶解或均勻分散，因此在最開始的取樣環(huán)節(jié)就帶來很大的困難。比如取樣的時(shí)候如果只取上清液，會造成取樣不均衡，結(jié)果不具有代表性；即使是充分混勻后快速取樣，藥物殘?jiān)鼤氯麨V膜，給過濾帶來很大的困難。即使是完成過濾，在培養(yǎng)觀察的時(shí)候，由于藥物殘?jiān)街跒V膜上，菌落生長情況也非常不容易觀察，不利于后續(xù)結(jié)果準(zhǔn)確性的保證。因此，稀釋供試品溶液和增加培養(yǎng)基體積的方法，是最好的選擇。

本研究經(jīng)過適用性試驗(yàn)，建立了瀉痢康腸溶膠囊的微生物限度檢查方法，最終得出結(jié)論：需氧菌總數(shù)和霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法采用的是供試品溶液稀釋法，需氧菌總數(shù)檢查時(shí)，供試品稀釋到10-3，霉菌和酵母菌總數(shù)檢查時(shí)，供試品稀釋到10-2；大腸埃希菌采用的是常規(guī)法；耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌采用的是增加培養(yǎng)基體積的方法，耐膽鹽革蘭陰性菌檢查時(shí)，培養(yǎng)基體積增加至15 ml，沙門菌檢查時(shí)，培養(yǎng)基體積增加至200 ml。采用上述方法，回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，該方法成立。