壯骨健膝方含藥血清對(duì)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制因子蛋白表達(dá)的影響

郭潔梅，陳秀明，陳 鵬，肖 艷，毛 驍，蘇友新*

（1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州350101；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥為主要病理改變的退行性疾病。已有研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。課題組前期對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外研究也證實(shí)，經(jīng)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞可抑制Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)水平，并伴有β-catenin蛋白表達(dá)增多，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）mRNA表達(dá)減少［2］，提示經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活。課題組針對(duì)KOA的臨床效驗(yàn)方—壯骨健膝方能提高經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，降低β-catenin蛋白的表達(dá)，提高GSK-3βmRNA的表達(dá)［3］，表明該方可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。Dickkopf相關(guān)蛋白1（Dkk-1）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白3（sFRP-3）是Wnt/β-catenin信號(hào)通路活動(dòng)的抑制因子［4-5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)壯骨健膝方含藥血清對(duì)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察不同時(shí)間段Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平的變化，探討壯骨健膝方是否通過(guò)調(diào)控Dkk-1、sFRP-3這兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，進(jìn)一步研究壯骨健膝方保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的可能分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只清潔級(jí)2周齡SD大鼠，雌雄各半，用于血清的制備；5只清潔級(jí)2周齡雄性SD大鼠，用于體外生長(zhǎng)良好的第三代軟骨細(xì)胞的取材。大鼠均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。大鼠在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，動(dòng)物環(huán)境合格證號(hào)：SCXK（閩）2009-0001。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清（美國(guó)Hyelone公司）；Dkk-1抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）；sFRP-3抗體（美國(guó)R&D公司）；青霉素-鏈霉素溶液（美國(guó)Thermo Scientific公司）；內(nèi)參β-actin、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Western Blot檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)、BIO-TEKELX 800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 壯骨健膝方藥液制備 壯骨健膝方由桑寄生15 g，骨碎補(bǔ)15 g，川牛膝15 g，杜仲9 g，獨(dú)活9 g，土鱉蟲6 g，生地黃15 g，秦艽9 g，鹿銜草10 g，腫節(jié)風(fēng)10 g組成，均購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。制備方法：中藥首煎用500 mL冷水浸泡20 min后，用武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火再煮20 min；次煎再加水500 mL，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火再煮30 min；將2次煎得的藥液混合，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含生藥1 g/mL的藥液，用玻璃瓶密封，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠含藥血清、空白血清制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只清潔級(jí)2周齡SD大鼠取20只，按人和大鼠體表面積換算法計(jì)算，予9.84 mL/（kg·d）壯骨健膝方藥液灌胃，其余20只予等體積生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃5 d。于末次灌胃3 h后于大鼠腹主動(dòng)脈采血，2 500 rpm離心25 min，分離血清，于56℃水浴滅活30 min，過(guò)濾，分裝，分別為大鼠含藥血清與空白血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 模型制備和分組

2.3.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、原代及傳代培養(yǎng) 選取5只清潔級(jí)2周齡大鼠，采用10%水合氯醛麻醉后脫頸處死，取雙膝關(guān)節(jié)面軟骨并清除殘留組織，將軟骨小塊剪至1 mm3大小，加0.2%Ⅱ型膠原酶3 mL，置37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，每2 h取1次上清液；懸浮液離心后收集軟骨細(xì)胞，共分離收集3次；收集到的軟骨細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）及青霉素-鏈霉素溶液各100 U/mL的培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×105個(gè)/mL，后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待軟骨細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3.2 模型制備及分組 取第三代生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL的密度接種在2塊六孔板中，采用含10 ng/mL IL-1β的10% FBS/DMEM培養(yǎng)基干預(yù)24 h后，隨機(jī)取3孔，依據(jù)課題組前期研究已形成的經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞制備方法［2］進(jìn)行模型鑒定。模型成功鑒定標(biāo)準(zhǔn)：在倒置顯微鏡下軟骨細(xì)胞形態(tài)顯示為成纖維樣、長(zhǎng)梭形，胞漿間隙變大，可見(jiàn)脂滴；經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)細(xì)胞外及基質(zhì)紫紅色易染顆粒減少；經(jīng)Ⅱ型膠原染色后提示Ⅱ型膠原表達(dá)減少。模型制備成功后，將剩下的9孔采用抽簽法取6孔，再采用數(shù)字隨機(jī)法將其分為空白血清組和含藥血清組，每組各3孔。

2.4 退變軟骨細(xì)胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 空白血清組采用含10%大鼠空白血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，含藥血清組采用10%大鼠含藥血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。2組分別于培養(yǎng)24、36、48、72 h時(shí)，采用Western Blot法檢測(cè)其中的Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平。具體步驟：RIPA裂解液裂解2組軟骨細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移至PVGF膜，5%脫脂奶粉封閉；分別加一抗、二抗孵育，經(jīng)ECL發(fā)光，在凝膠成像儀下顯影、拍照，并使用凝膠圖像分析計(jì)算2個(gè)蛋白與內(nèi)參二者的光密度比值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

2組退變軟骨細(xì)胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1、表1。

圖1 2組退變軟骨細(xì)胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白電泳圖

表1 2組退變軟骨細(xì)胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 2組退變軟骨細(xì)胞中Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與24 h比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與36 h比較，3）P＜0.05；與空白血清組同一時(shí)間點(diǎn)比較，4）P＜0.05，5）P＜0.01。

時(shí)間24 h 36 h 48 h 72 h 24 h 36 h 48 h 72 h組別空白血清組含藥血清組n 3 3 Dkk-1 1.150±0.193 1.052±0.135 0.811±0.0981）0.793±0.1831）1.290±0.277 1.383±0.1131）4）1.652±0.3082）3）5）1.707±0.0932）3）5）sFRP-3 2.424±0.382 2.379±0.301 2.156±0.4961）2.101±0.4951）2.433±0.213 2.613±0.2631）4）2.871±0.1112）3）5）2.926±0.4662）3）5）

4 討 論

Wnt/β-catenin通路系統(tǒng)的激活在KOA關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程扮演著重要角色，在關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)與功能的維持方面起著非常重要的作用，一直是關(guān)節(jié)軟骨病變研究的熱點(diǎn)［6］。該通路的激活會(huì)通過(guò)多途徑促進(jìn)軟骨細(xì)胞的破壞，加速軟骨的退變，進(jìn)而影響關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能。

壯骨健膝方是課題組在梳理大量文獻(xiàn)及多年臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，針對(duì)改善KOA臨床表現(xiàn)而創(chuàng)立的效驗(yàn)方，該方由骨碎補(bǔ)、杜仲、桑寄生、獨(dú)活等組成，可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通絡(luò)止痛，臨床療效顯著［7-8］。前期通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：該方可通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及合成膠原、抑制軟骨的降解等起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用［3］。此外，該方還可抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路的激活并減少下游產(chǎn)物對(duì)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)的損害［9］，但對(duì)該信號(hào)通路激活過(guò)程的具體抑制環(huán)節(jié)還不明確。DKK-1是一種分泌型蛋白，通過(guò)與其相應(yīng)的受體結(jié)合來(lái)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳遞，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)激活［10-11］。sFRPs是Wnt信號(hào)通路分泌型拮抗劑的最大家族，研究表明sFRP-3可通過(guò)半胱氨酸區(qū)域（CRD）與主要的Wnt蛋白受體結(jié)合形成無(wú)功能復(fù)合體，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)，在骨代 謝 方 面 作 用 明 顯［12］。因 此，我 們 選 擇DKK-1、sFRP-3做為觀察指標(biāo)，旨在探討壯骨健膝方在Wnt/β-catenin信號(hào)通路跨膜信號(hào)傳遞階段對(duì)該通路激活的影響。

本研究結(jié)果顯示：空白血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間而逐漸下降，48 h和78 h均顯著低于24 h（P均＜0.05），證實(shí)了經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變伴有Wnt/β-catenin通路激活，這與我們前期研究結(jié)果一致。經(jīng)壯骨健膝方含藥血清干預(yù)后，在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)期內(nèi)，含藥血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，其中干預(yù)36 h高于24 h（P＜0.05），干預(yù)48 h和72 h顯著高于24 h（P均＜0.01），干預(yù)48 h和72 h高于36 h（P均＜0.05）；與空白血清組同一時(shí)間點(diǎn)比較，含藥血清組DKK-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平在干預(yù)36 h、48 h和72 h時(shí)均顯著增高（P＜0.05或0.01）。提示壯骨健膝方含藥血清能夠增加Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平，抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路被激活。

本研究從Dkk-1、sFRP-3在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用環(huán)節(jié)分析而知，壯骨健膝方含藥血清可能對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有抑制作用，揭示了壯骨健膝方保護(hù)膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞的可能分子機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，與其他復(fù)方相似，壯骨健膝方具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)，本研究?jī)H從增加Wnt/βcatenin信號(hào)通路抑制因子Dkk-1、sFRP-3蛋白表達(dá)水平探討該方保護(hù)膝關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞的分子機(jī)制，具有一定的局限性。