分泌卷曲相關(guān)蛋白4肝臟高表達轉(zhuǎn)基因小鼠的制作及鑒定分析

關(guān) 華，鄭慧媛，劉恩岐，徐禮鮮，余 琦

(1. 西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所 陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，陜西西安 710021；2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710032；3. 西安醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，陜西西安 710021；4. 西安交通大學(xué)心血管研究中心脂代謝與動脈粥樣硬化研究室，陜西西安 710061)

分泌卷曲相關(guān)蛋白4(secreted frizzled-related protein 4, SFRP4)是SFRPs家族成員之一，包含一個半胱氨酸富集的區(qū)域，這一序列與Wnt結(jié)合的Frizzled蛋白結(jié)合位點同源[1]。SFRPs作為Wnt信號通路可溶性調(diào)節(jié)因子，主要通過兩種途徑調(diào)節(jié)Wnt下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，競爭性地與膜受體Frizzled蛋白結(jié)合，或者直接與Wnt蛋白結(jié)合。已有報道指出，SFRPs家族蛋白SFRP4通過調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路促進人前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化[2]。此外，肥胖個體內(nèi)臟脂肪組織SFRP4表達水平顯著上調(diào)，并且其在內(nèi)臟脂肪組織中的分泌與胰島素抵抗相關(guān)[3]。血清中SFRP4的表達水平與葡萄糖刺激的胰島素分泌和葡萄糖耐量呈負相關(guān)，這一研究結(jié)果與此前報道的結(jié)果一致，即SFRP4在2型糖尿病患者胰島細胞中過表達，并且抑制葡萄糖耐受性和胰島素分泌[4]。

本研究擬制備SFRP4肝臟組織特異性高表達轉(zhuǎn)基因小鼠。首先，社會經(jīng)濟水平的提高導(dǎo)致人類的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使世界范圍內(nèi)肥胖癥的發(fā)生率明顯升高[5]。世界各國的科學(xué)家針對如何治療肥胖以及如何緩解肥胖癥的發(fā)生進行了大量研究和探索，而SFRP4是最新發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子[6]，可能在治療肥胖癥的過程中發(fā)揮重要作用[7]。其次，SFRP4廣泛表達于人和小鼠的各個臟器及組織，脂肪、肌肉和肝臟作為胰島素作用的靶器官，表達水平較高[8]，因此，SFRP4表達水平的增高或降低對胰島素的敏感性以及葡萄糖轉(zhuǎn)運和消耗密切相關(guān)[9]。最后，有研究發(fā)現(xiàn)，將人SFRP4基因編碼序列轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，并不能導(dǎo)致小鼠血糖升高[10]。因此，我們推測，人和小鼠SFRP4基因配體-受體結(jié)合存在差異，不能很好地相互結(jié)合而發(fā)揮作用，對于小鼠模型來說有很多局限性。因此，建立SFRP4過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探索在動物水平過表達SFRP4蛋白是否能夠調(diào)控小鼠不同部位脂肪組織的蓄積及能量代謝，對于研究由SFRP4引起的肥胖癥、2型糖尿病及胰島素抵抗至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 動物本研究中用到的雄性和雌性C57BL/6J小鼠各40只，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔北京 SYXK(京)2017-0033〕。動物3只1籠，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級，室內(nèi)溫度保持在(22±2) ℃，光照(12 h明/12 h暗)、噪聲等均符合國際要求(GB14925-2010)，自由飲水和采食。研究方法和倫理審查通過西安醫(yī)學(xué)院實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，遵循美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》(2011年第8版)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑RT-PCR Mix、逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Green(TaKaRa，日本)，質(zhì)粒小提試劑盒(Omega，美國)，鼠尾直接PCR試劑盒(Bimake，美國)，RNA提取試劑盒(TaKaRa，日本)，蛋白提取試劑盒(Omega，中國)，SFRP4抗體(Abcam，美國)，MluⅠ和ClaⅠ內(nèi)切酶(Fermentas，立陶宛)。

1.3 轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建采用顯微注射方法制作SFRP4轉(zhuǎn)基因小鼠。顯微注射、核移植及孕鼠的待產(chǎn)均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心進行〔SYXK(陜)2012-005〕。

1.3.1基因載體的構(gòu)建 小鼠SFRP4基因的cDNA序列全長1 056 bp，通過連接酶與骨架載體質(zhì)粒pJC13連接，pJC13載體攜帶ApoE啟動子。由于ApoE啟動子在肝臟中特異性高表達，故調(diào)控攜帶的SFRP4基因在肝臟高表達，載體連接成功后，酶切鑒定后用于顯微注射。

1.3.2顯微注射 根據(jù)高守翠等[11]建立的實驗方法，首先將鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒載體內(nèi)切酶酶切線性化，隨后利用顯微注射技術(shù)將其注入小鼠受精卵。20 d左右仔鼠出生，剪少量鼠尾并提取組織DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，用于SFRP4基因表達及功能的研究。

1.3.3模型鑒定 剪取仔鼠少量鼠尾組織，按照鼠尾直接PCR試劑盒說明書提取基因組DNA，PCR鑒定鼠尾基因型。引物序列：Forward 5′-ACCTGAATTCACAGTTGTCTGTGTG-3′，Reverse 5′-CAGATGCGTGAAACTTGGTGAATCT-3′。反應(yīng)體系為2×M-PCR OPTITMMix(10 μL)，引物(正向/反向)各1 μL(10 mmol)，DNA模板1 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)，RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(20 g/L)。

1.4 目的基因表達分析PCR鑒定得到的SFRP4轉(zhuǎn)基因陽性小鼠以及同窩對照經(jīng)安樂處死后，分離肝臟并提取總RNA和總蛋白備用。qRT-PCR檢測SFRP4在肝臟中的mRNA表達。引物序列：SFRP4(97 bp)，F(xiàn)orward 5′-AAGCCGACCCTGGCAACATA-3′，Reverse 5′-TTGTGACCTCATTGCAACCACTC-3′；β-actin(171 bp)，F(xiàn)orward 5′-GCGGCATCCACGAAACTAC-3′，Reverse 5′-TGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′。反應(yīng)體系為SYBR Green 10 μL，引物(正向/反向)各1 μL(10 mmol)，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 40 s，40個循環(huán)。Western blotting檢測肝臟組織中SFRP4蛋白相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 基因構(gòu)建分別提取pJC13-ApoE(攜帶ApoE啟動子的質(zhì)粒載體)和pUC57-SFRP4(攜帶SFRP4基因cDNA序列的質(zhì)粒載體)質(zhì)粒DNA，用ClaⅠ和MluⅠ分別雙酶切DNA片段，將酶切后的產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離20 min，分別切膠回收ApoE載體和 SFRP4 cDNA片段(圖1)，Nano Drop檢測回收DNA片段的濃度，以備下一步ApoE載體和SFRP4片段進行連接反應(yīng)。

圖1 雙酶切pJC13-ApoE和pUC57-SFRP4質(zhì)粒Fig.1 Double enzymed digestion of pJC13-apoE and pUC57-SFRP4 plasmids

按照說明書操作程序，將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，挑取菌株接種至液體培養(yǎng)基中擴增菌液，用引物擴增SFRP4片段檢測菌液是否為陽性克隆。結(jié)果顯示，在Marker為1 000 bp左右的位置得到SFRP4的片段，片段大小為1 056 bp(圖2)。

圖2 菌液PCR擴增SFRP4 CDs區(qū)(1 056 bp)Fig.2 SFRP4 CDs region amplified by bacterial PCR (1 056 bp)

擴增菌液PCR鑒定的陽性克隆，提取質(zhì)粒后通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒片段的長度，pJC13-ApoE-SFRP4陽性質(zhì)粒長度大于10 000 bp(圖3)，篩選陽性質(zhì)粒進行測序鑒定。由此證明pJC13-ApoE-SFRP4質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，可進行下一步顯微注射操作，制作SFRP4轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖3 10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的大小Fig.3 Plasmid size determined by 10 g/L agarose gel electrophoresis

2.2 基因型鑒定代孕母鼠胚胎移植20 d左右，乳鼠出生，約3周后剪少量鼠尾組織，提取組織DNA后，PCR鑒定SFRP4轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，表示為Tg小鼠。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)PCR結(jié)果判斷SFRP4轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，其中陽性小鼠PCR得到約300 bp的PCR產(chǎn)物(圖4)。

圖4 20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定野生型(wild type，WT)和apoE-SFRP4轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠基因型Fig.4 Wild type and apoE-SFRP4 transgenic mice genotypes identified by 20 g/L agarose gel electrophoresis

2.3 轉(zhuǎn)基因效率鑒定分別檢測轉(zhuǎn)基因小鼠以及同窩對照肝臟組織中SFRP4基因表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠SFRP4基因和蛋白表達水平明顯高于同窩對照，說明成功構(gòu)建并獲得SFRP4轉(zhuǎn)基因小鼠，并且SFRP4的表達水平明顯高于野生型小鼠(圖5、圖6)。

圖5 WT和Tg小鼠肝臟中SFRP4 mRNA表達Fig.5 SFRP4 mRNA expression determined in the liver of WT and SFRP4 transgenic mice數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=6。與WT比較，**P<0.01。

圖6 WT和Tg小鼠肝臟中SFRP4蛋白表達Fig.6 The protein expression level of SFRP4 determined by Western blotting數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=6。與WT比較，**P<0.01。

3 討 論

將外源DNA通過生命科學(xué)手段導(dǎo)入小鼠生殖系是當(dāng)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展強有力的工具。為了確定特定組織表達某種遺傳因素以及其在發(fā)育個體中的生物學(xué)功能和特性，或者探索某個未知基因在個體發(fā)育過程中不恰當(dāng)高表達的后果，都可以利用轉(zhuǎn)基因動物模型進行階段性研究。因此，轉(zhuǎn)基因動物的制作是傳統(tǒng)且有效的技術(shù)方法，為生命科學(xué)的發(fā)展帶來了巨大變化[12-13]。受精卵原核顯微注射法制備的轉(zhuǎn)基因動物，1個或多個攜帶的外源DNA拷貝的質(zhì)粒序列整合到受精卵染色體上，最常見的情況是，注入的DNA以多個頭-尾相連的拷貝整合到小鼠基因組中，隨著細胞的分裂而擴增，能夠穩(wěn)定遺傳給子代，因此轉(zhuǎn)基因動物在生長發(fā)育過程中表現(xiàn)某種特殊的形態(tài)或者獲得某種特殊的功能[14]?；蚪M分析結(jié)果顯示，人和小鼠基因組高度同源，基因相似率達到95%，發(fā)育和生活過程相似，生理和生化反應(yīng)基本相同，環(huán)境和藥物代謝的變化非常相似。因此，人類疾病相關(guān)的動物模型大多選擇小鼠進行科學(xué)研究[15]。目前國內(nèi)外已建立了成熟的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法，主要應(yīng)用于基因功能研究、動物遺傳改良、動物疾病模型及器官移植的研究[16]。

轉(zhuǎn)基因小鼠為研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)潛在的機制提供了非常有用的模型，主要有以下4個方面：第一，轉(zhuǎn)基因小鼠可以為研究脂肪細胞功能提供相關(guān)的組織環(huán)境[17]；第二，在次級突變發(fā)生之前，轉(zhuǎn)基因小鼠提供分析基因?qū)υ鲋臣胺只闹饕绊慬18]；第三，攜帶不同基因的轉(zhuǎn)基因小鼠之間的雜交揭示了其在轉(zhuǎn)化過程的協(xié)同作用能力[19]；第四，轉(zhuǎn)基因小鼠特定的基因可以用于尋找新的或反向基因的相互協(xié)同作用[20]。本研究利用肝臟高表達基因ApoE作為SFRP4的啟動子，確保SFRP4基因高豐度表達于小鼠肝臟組織。

本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建SFRP4轉(zhuǎn)基因小鼠，作為分泌型糖蛋白，SFRP4蛋白在細胞質(zhì)中合成后，經(jīng)修飾信號肽斷裂穿過細胞膜分泌到細胞外[21]，肝臟是重要的造血、儲血器官，在肝臟中合成SFRP4蛋白后經(jīng)血液輸送到達全身，上調(diào)小鼠周身SFRP4蛋白表達。此外，我們注意到，轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中SFRP4基因和蛋白表達與同窩對照小鼠相比明顯升高，證明SFRP4肝臟特異性高表達轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功。