BALB/C小鼠骨髓源性樹突狀細胞的定向誘導分化及鑒定

周文旭，吳曉燕，施秉銀，倪 寧，丁晨光，管智慧，姜亞卓，項和立

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710061；2.西安交通大學醫(yī)院內(nèi)科，陜西西安 710049)

樹突狀細胞(dendritic cell, DC)的來源及分化發(fā)育的成熟度與其功能關系緊密。人體內(nèi)DC具有成熟和未成熟兩種形態(tài)，前者是早期免疫應答強有力的抗原遞呈細胞(APC)，后者能誘導免疫耐受[1]。致耐受性樹突狀細胞(tDC)是誘導機體特異性免疫耐受的強有力工具。然而，由于DC在體內(nèi)含量極微，無法從活體組織直接分離獲得足量DC。造血干細胞(HSC)具有高度自我更新的能力和多能分化的潛能，是分化為DC的主要造血前體細胞，骨髓中的HSC含量遠高于脾臟和外周血[2]。近年來，國內(nèi)外研究報道，使用特定的細胞因子組合方案可以有效誘導小鼠骨髓HSC體外擴增并向DC定向分化[3]。免疫磁珠法具有分選純度高、高效快速、操作簡單等優(yōu)點[4]。

雌性BALB/C小鼠是目前主要的Graves病(GD)動物模型。GD是器官特異性自身免疫性疾病，發(fā)病率高，可累及全身多個系統(tǒng)，對人類生命健康危害很大。近年來，機體免疫系統(tǒng)對某些自身成分免疫耐受的誘導和重建是自身免疫性疾病研究備受關注的焦點，維持或重建機體對自身抗原TSH受體(TSHR)的有效免疫耐受，可能成為一種防治甲狀腺功能亢進癥的新方法。DC仍然是GD免疫應答中的主要APC[5]。由于DC在免疫耐受誘導中的重要作用，建立一種能長期穩(wěn)定地獲得BALB/C小鼠骨髓源性DC并進行鑒定的有效方法成為GD免疫耐受相關研究的關鍵。目前尚沒有應用免疫磁珠法自BALB/C小鼠中分離純化誘導未成熟DC(imD)的研究報道。

本研究應用免疫磁珠法，自BALB/C小鼠骨髓中分離、純化CD117+HSC，再加入相應的細胞因子促進HSC體外擴增，并誘導HSC定向分化為DC，最后進行形態(tài)、功能及表面標志鑒定，建立DC前體細胞的儲備庫，為進一步行基因修飾DC誘導GD免疫耐受研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級別健康雌性BALB/C 8周齡小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑 重組小鼠細胞因子：干細胞因子(rmSCF)、白細胞介素3(rmIL-3)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、白細胞介素4(rmIL-4)、白細胞介素10(rmIL-10)、腫瘤壞死因子α(rmTNF-α)購自美國R&D公司(貨號分別為455-MC-010、403-ML-010、415-ML-010、404-ML-010、417-ML-025、410-MT-010)。FITC標記的流式細胞計數(shù)抗體(FITC anti-mouse CD11c、FITC anti-mouse CD40、FITC anti-mouse CD80、FITC anti-mouse CD86、FITC anti-mouse I-A/I-E)及FITC標記的同型對照抗體(FITC Armenian Hamster IgG、FITC Armenian Hamster IgM、FITC Armenian Hamster IgG、FITC Rat IgG2a、FITC Rat IlgG2b)購自美國BioLegend公司(貨號分別為117305、124608、104705、105109、107606)。脂多糖(LPS)購自美國Invitrogen公司(貨號tlrl-pglps)。小鼠IL-12 ELISA檢測試劑盒購自美國BioSource公司(貨號HZ-E0644m)。

1.1.3主要儀器 免疫磁珠分離系統(tǒng)：德國MiltenyiBiotec GmbH公司專利產(chǎn)品MiniMACS & MidiMACS。倒置相差顯微鏡：日本NIKON公司TE2000-U型。掃描電子顯微鏡：日本電子(JEOL)公司JSM-840。透射電子顯微鏡：日本日立(HITACHl)公司H-600。流式細胞儀：美國BD公司FACS Calibur。酶聯(lián)免疫檢測儀：美國Biokit公司Elx800。

1.2 方法

1.2.1BALB/C小鼠骨髓來源的CD117+HSC分離純化及體外增殖 將BALB/C小鼠斷頸處死，于超凈工作臺中取出股骨，用含雙抗1640培養(yǎng)基注入骨髓腔反復沖洗，用100目篩網(wǎng)過濾制成單細胞懸液，加入2 mL紅細胞裂解液，離心、重懸、細胞計數(shù)。利用免疫磁珠分離系統(tǒng)(MACS)自小鼠骨髓中分離、純化CD117+HSC，接種于6孔板中，每孔加入25 ng/mL的rmSCF以及rmIL-3培養(yǎng)7 d，刺激HSC擴增，對比擴增前后細胞數(shù)量，了解擴增倍數(shù)。

1.2.2HSC定向誘導分化為DC 加入相應的細胞因子，使HSC定向分化為DC。將上述擴增所得的造血干細胞加入基礎因子rmGM-CSF(50 ng/mL)及rmIL-4(20 ng/mL)，以后每3 d以半量添加[6]。3 d后，將所得的造血干細胞分為兩組：擬分化為未成熟DC(imDC)組和擬分化為成熟DC(mDC)組。在rmGM-CSF及rmIL-4基礎上，imDC組中加入rmIL-10(20 ng/mL)抑制成熟[7]，mDC組中加入rmTNF-α(20 ng/mL)促其分化為成熟[8]。以后每3 d以半量添加。同時追加細胞因子rmIL-4和rmGM-CSF。每日在倒置相差顯微鏡下觀察，比較兩組細胞在形態(tài)學方面的差異，總計培養(yǎng)7～9 d。

1.2.3DC的超微結構及吞噬功能檢查 培養(yǎng)第9天，收獲兩組細胞(imDC和mDC)，分別制作標本行掃描及透射電子顯微鏡檢查，觀察細胞超微結構以及吞噬功能。其中imDC組于第9天提取部分細胞，加入凋亡細胞，共培養(yǎng)2 h，制作標本后行電鏡檢查，觀察其吞噬功能。

1.2.4DC表型分析 培養(yǎng)第9天，收獲DC(imDC和mDC)，加入死活染料去除死細胞和細胞碎片，將imDC和mDC分別根據(jù)所加入的不同標記抗體分組。收集細胞，800 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞2次并重懸，調(diào)整細胞密度為5×106/mL，加入1 mL預冷的40 g/L多聚甲醛，4 ℃固定40 min，800 r/min離心5 min，再用PBS重懸細胞，每管細胞1×106個，體積為100 μL。分裝，然后逐一加入不同的FITC標記抗體及其對照抗體，避光孵育后用PBS緩沖液沖洗，重懸成單細胞懸液，制作流式細胞計數(shù)標本，將標記好的樣品置入流式細胞儀，激發(fā)光波長488 nm檢測FITC熒光，應用流式細胞計數(shù)(FACS)比較兩組細胞在表面標志表達方面的差異。

1.2.5DC功能檢測 檢測脂多糖(LPS)刺激對DC細胞因子分泌量的影響。培養(yǎng)第8～9天，收獲兩組DC(imDC和mDC)。兩組DC細胞再分為A、B兩組，A組DC(imDC和mDC)培養(yǎng)液中分別加入10 μg/mL LPS培養(yǎng)24 h；B組DC(imDC和mDC)繼續(xù)原培養(yǎng)方案，不加LPS刺激，作為對照。分別于LPS刺激前以及刺激后24 h收集4組細胞的培養(yǎng)上清，應用IL-12試劑盒，采取ELISA法測定IL-12的濃度，以此比較4組細胞在LPS刺激前后上述細胞因子分泌量的變化，以及刺激組和未刺激組之間的差異。

1.3 統(tǒng)計學分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。分類變量采用數(shù)字或者百分比表示，連續(xù)變量采用平均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析及SNK兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BALB/C小鼠骨髓來源的CD117+HSC分離純化及體外增殖情況在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，自每只BALB/C小鼠股骨骨髓中可得到4×107～6×107個有核細胞，經(jīng)MACS系統(tǒng)分離、純化的CD117+HSC有3×105～5×105個，純度在95%以上。加入HSC刺激因子mSCF及mIL-3后，觀察HSC體外增殖情況。結果表明，mSCF加mIL-3方案可以有效刺激HSC擴增，細胞數(shù)在接種第3、5、7天分別可達到接種時的(10.34±1.43)倍、(22.65±2.71)倍、(54.39±3.08)倍。對兩組小鼠造血干細胞進行凍存與復蘇，復蘇后細胞回收率達(84.04±2.83)%。

2.2 定向分化的DC形態(tài)學表現(xiàn)在光鏡下和電鏡下比較兩組細胞，mDC和imDC在光鏡(圖1)和掃描電鏡下(圖2)的形態(tài)有明顯差異，主要表現(xiàn)在樹突的密度、長度方面，mDC組細胞樹突相對較為粗大，呈樹枝狀或星狀，imDC組細胞樹突相對短小，呈毛刺狀；透射電鏡下(圖3)imDC核深染，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，近膜側有較多吞飲泡，可見吞噬凋亡細胞現(xiàn)象。

倒置相差顯微鏡顯示，imDC細胞表面出現(xiàn)少量的毛刺狀突起，形態(tài)稍不規(guī)則(圖1A)；mDC細胞表面有粗大的樹枝狀或星狀突起，細胞形態(tài)不規(guī)則(圖1B)。

圖1 BALB/C小鼠骨髓來源的DC培養(yǎng)(倒置相差顯微鏡, ×400)Fig.1 DC culture from bone marrow of BALB/C mice (inverted phase contrast microscope, ×400)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

掃描電鏡顯示，imDC細胞呈球形或不規(guī)則形，細胞表面不光滑，可見到許多短小的突起(圖2A)；mDC的細胞形態(tài)基本同imDC，其表面粗糙，細胞表面突起較長且多，呈毛刺狀、樹枝狀或星形突起(圖2B)。

圖2 BALB/C小鼠骨髓來源的DC(掃描電鏡, ×4 000)Fig.2 DCs from bone marrow of BALB/C mice (scanning electron microscope, ×4 000)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

透射電鏡顯示，imDC細胞形狀不規(guī)則，細胞表面有較多的微絨毛樣突起；核深染，細胞核不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，核仁可見；細胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體較小，嵴結構清晰；近膜側有較多吞飲泡，細胞質(zhì)內(nèi)還可見到被吞噬的細胞碎片及細胞的吞噬現(xiàn)象(圖3A)。mDC細胞形態(tài)仍然不規(guī)則，細胞表面的突起較多，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，線粒體數(shù)量較imDC組明顯增多，未見到凋亡細胞及細胞的吞噬現(xiàn)象(圖3B)。

圖3 BALB/C小鼠骨髓來源的DC(透射電鏡, ×4 000)Fig.3 ImDCs and mDCs from bone marrow of BALB/C mice (TEM, ×4 000)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

2.3 DC表型分析DC表型分析的流式圖見圖4。流式細胞計數(shù)結果以百分比的形式表示。CD11c在imDC與mDC中均呈較高水平表達，兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。CD40、CD80、CD86、I-A/I-E在imDC中呈低水平表達，而在mDC的表達水平明顯增加，呈中水平或高水平表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表現(xiàn)為特征性的成熟DC表型(圖4)。

圖4 流式細胞計數(shù)檢測imDC及mDC細胞表面標志的表達Fig.4 FACS of the expressions of imDC and mDC cell surface markers

2.4 DC功能檢測應用LPS刺激DC，比較imDC和mDC在LPS刺激前、后以及未刺激狀態(tài)下IL-12分泌量變化。結果表明(圖5)，在LPS刺激前(A1)，imDC組及mDC組IL-12分泌量差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025)。使用LPS刺激24 h后，imDC組(A2)的IL-12分泌量較刺激前(A1)輕度升高(P=0.037)，與LPS未刺激組(B)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.064)；而mDC組IL-12分泌量在LPS刺激后24 h(A2)較刺激前(A1)明顯升高(P=0.007)，與未刺激組(B)比較差異也有統(tǒng)計學意義(P=0.009)。imDC組及mDC組兩組細胞在LPS刺激后IL-12分泌量差值差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。結果表明，LPS刺激在促進DC成熟上與TNF-α有協(xié)同作用，imDC在LPS刺激后其IL-12分泌量的上調(diào)不如mDC顯著，可能與IL-10的作用有關。

圖5 LPS刺激前后各組DC的IL-12分泌量Fig.5 IL-12 secretion of DCs before and after LPS stimulation

3 討 論

不同DC亞群的免疫功能有不同特點，機體imDC主要來源于骨髓中的HSC[9]，如何在體外分離培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量和純度的功能性DC成為相關領域研究進展的瓶頸。雌性BALB/C小鼠是目前主要的GD動物模型。研究表明，HSC的分化能力在幼年小鼠優(yōu)于老年小鼠[10]。因此，本研究采用健康雌性4～6周齡幼年BALB/C小鼠，自BALB/C小鼠股骨骨髓中分離DC的前體細胞。

HSC形態(tài)學上缺乏特異性，目前只能借助于其表面標志進行分選純化。CD117(c-kit)即HSC生長因子受體(SCFR)，高水平表達于多能干細胞表面，干細胞因子結合CD117后促進HSC增殖分化，CD117是目前公認的小鼠HSC分選的重要標志[11]。目前有多種HSC分選方法，主要包括組織培養(yǎng)瓶貼壁、親和吸附柱、熒光活化細胞分選系統(tǒng)(FACS)、免疫磁珠分離系統(tǒng) (MACS)等。前2種方法DC的產(chǎn)率和純度不高、影響細胞活力、易于污染且費時費力。FACS和MACS均是免疫學細胞分選方法，能快速高效地分離純化體內(nèi)含量極少的一些細胞群。但FACS分選速度較慢(每小時處理約2.0×107個細胞)、技術要求高、儀器設備昂貴；MACS應用單克隆抗體熒光染色法與免疫吸附細胞分離技術相結合，能直接從大樣本中分離純化特定細胞，并且可以高純度地分選出稀有細胞[4]，具備不影響細胞活性、分選效率高、回收率高、分離純度好、高效快速、操作步驟簡便等優(yōu)點。本研究采用德國Miltenyi Biotec GmbH公司的專利產(chǎn)品CD117單克隆抗體標記的免疫磁珠陽性選擇法體外分離純化HSC。經(jīng)MACS系統(tǒng)分離、純化得到的CD117+HSC 5×105～6×105，占骨髓有核細胞總數(shù)0.9%左右，與文獻報道相符[11]。CD117+HSC純度在95%以上，解決了以往方法所分選的HSC純度低這一缺陷。

既往研究表明，細胞因子不同的組合方案以及不同濃度時，HSC擴增效果會有顯著差異[12]。在本研究中，使用SCF加IL-3細胞因子組合對HSC進行培養(yǎng)擴增，結果表明，加入SCF和IL-3可以有效刺激HSC擴增，較以往研究節(jié)約了培養(yǎng)成本[12]。

體外條件下，DC的誘導培養(yǎng)必須通過細胞因子刺激其生長，針對不同前體細胞加入不同細胞因子和不同培養(yǎng)條件，能夠改變DC的表型及功能。GM-CSF可以調(diào)控HSC向DC、單核細胞和巨噬細胞分化，而IL-4有利于HSC向DC定向分化，并使DC維持在未成熟狀態(tài)[13]。研究表明，小鼠骨髓HSC在GM-CSF和IL-4刺激后24～48 h即能分化為DC[3]。IL-10可使DC維持于未成熟狀態(tài)，并促進Th1 細胞分化，誘導T 細胞無能[14]。TNF-α是在體外培養(yǎng)中促進HSC分化而且促進DC成熟的必備因子[15]。一些免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)如LPS、PGE2等可以促進DC成熟[16]。本研究參考以往的研究[6]，聯(lián)合應用rmGM-CSF和rmIL-4體外誘導HSC定向分化為DC，并加入不同的細胞因子控制DC的成熟度。結果顯示，聯(lián)合應用rmGM-CSF(50 ng/mL)及rmIL-4(20 ng/mL)可以有效誘導DC定向分化，所培養(yǎng)細胞具有典型的DC形態(tài)特征，均明顯有別于單核細胞和巨噬細胞，并且隨著時間的推移這種變化越來越明顯(圖1，圖2，圖3)。FACS細胞表型分析證實所培養(yǎng)的DC為淋巴系DC。在體外誘導分化的過程中，相比以往研究[16]，本研究的GM-CSF用量相對較小，表明低劑量GM-CSF有利于保持DC的未成熟狀態(tài)。

DC具有異質(zhì)性，而人類及小鼠的DC表面，無論成熟狀態(tài)如何，CDllc表達均為陽性(人類漿細胞DC除外)[17]。CD830、CD80、CD86及CD40分子是成熟DC表面代表性的標志物，DC成熟活化時，上述分子的表達上調(diào)[17]。除CD11c+外，imDCs缺乏特異性表面標志[17]。本研究結果表明，未成熟DC組和成熟DC組均高表達CD11c，證實所培養(yǎng)的DC為淋巴系DC。加入了TNF-α刺激培養(yǎng)的mDC組，細胞表面標志CD40、CD80、CD86及I-A/I-E(MHC-Ⅱ類分子)的表達明顯增強，表現(xiàn)為特征性的成熟DC表型；而imDC組低水平表達CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ類分子，與文獻報道的imDC表型特征一致[17]。所獲得的imDC在細胞形態(tài)、表面標志表達、功能上均符合imDC的生物學特征，證實在GM-SCF和 IL-4 誘導HSC向DC定向分化的基礎上加入IL-10培養(yǎng)方案可以有效誘導小鼠imDC定向分化。

IL-12對DC的發(fā)育成熟及功能發(fā)揮關鍵作用。imDCs能分泌少量IL-12，DC在成熟過程中會大量分泌IL-12。有研究認為，LPS可以刺激DC成熟，誘導DC分泌IL-12，并上調(diào)IL-10和TNF-α的分泌[16]。本研究表明，LPS與TNF-α在刺激DC成熟上有協(xié)同作用，LPS刺激后imDC和mDC所分泌的細胞因子量存在顯著差異，可利用這一點進行DC功能鑒定。

綜上所述，本研究證明，使用特定的細胞因子組合方案可以有效誘導小鼠骨髓HSC向DC定向分化，并可以較精確地控制DC的成熟度。小鼠mDC及imDC在細胞形態(tài)、表面標志物、功能及LPS刺激后細胞因子分泌量方面存在顯著差異，利用這些指標可以鑒定DC的成熟度。本研究成功建立了一套自GD模型動物雌性BALB/C小鼠中長期穩(wěn)定地獲得DC特別是imDC并對其進行鑒定的有效方法，為誘導小鼠免疫耐受預防甲狀腺功能亢進癥的實驗研究提供了必要的實驗基礎。