育雛早期應(yīng)用氟苯尼考對(duì)禽腺病毒感染雛雞病情的影響

孟凡亮，劉蒙昊，宋一諾，張 慧，李 焱，曹龍龍，焦秋林，肖一紅，劉思當(dāng)*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018；2.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430072)

氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)LO)為目前動(dòng)物專用的廣譜抗菌藥物。該藥最初于20世紀(jì)90年代被研發(fā)成功，作為氯霉素和甲砜霉素的替代藥物而被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。該藥進(jìn)入細(xì)菌菌體后可以與其核糖體50S大亞基上的A位點(diǎn)緊密結(jié)合并影響肽鏈延伸過程中肽酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，使肽鏈的延長被終止，最終達(dá)到抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生成和抗菌的目的[2]。但近年來，其毒副作用開始受到人們的關(guān)注且相關(guān)報(bào)道也越來越多。截至目前，已被報(bào)道的FLO的毒副作用包括造血和免疫毒性[3-5]、基因毒性[6]及胚胎毒性[1]等。研究表明，F(xiàn)LO考雖然不會(huì)造成機(jī)體的再生障礙性貧血，但能夠?qū)е聶C(jī)體較強(qiáng)的免疫抑制。

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)adv)是無囊膜的雙股DNA病毒，根據(jù)其抗原性的不同，禽腺病毒被分為3個(gè)群(Fadv-Ⅰ～Ⅲ)，Ⅰ群禽腺病毒又分為5個(gè)亞群(A～E)、12個(gè)血清型(Fadv-1～11，其中Fadv-8又分為a和b 2個(gè)型)[7-9]。1987年，巴基斯坦的安卡拉第1次發(fā)生了心包積液綜合征(HPS)，所以又有“安卡拉病”之稱[10]，該病由Ⅰ群的血清4型禽腺病毒(Fadv-4)所引起，主要病變是心包腔內(nèi)有清亮或膠胨樣積液和肝臟出血性壞死及形成核內(nèi)包涵體。之后，HPS在世界各地多有發(fā)生的報(bào)道，包括韓國[11]、日本[12]、波蘭[13]和匈牙利[14]。自2015年以來，該病在我國暴發(fā)流行，使養(yǎng)雞業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)通過對(duì)Fadv-4感染SPF雛雞并應(yīng)用飲水給藥，監(jiān)測死亡及排毒情況，并對(duì)免疫器官干擾素相關(guān)基因及細(xì)胞因子基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，綜合評(píng)價(jià)應(yīng)用FLO對(duì)禽腺病毒感染雛雞病情的影響，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)FLO的毒副作用，為臨床合理使用氟苯尼考提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑SPF雞胚及雛雞購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所；FLO粉劑(含量≥98%)購自浙江國邦藥業(yè)有限公司；TRIzol試劑購自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清 (FBS) 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒購自東洋紡公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)將90羽1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、Fadv-4組、Fadv-4+FLO組,每組30只。雛雞3日齡時(shí)進(jìn)行頸部皮下注射攻毒，每只雞107TCID50/0.2 mL，同時(shí)用藥組3日齡開始飲水給藥FLO(100 mg/L)，連續(xù)給藥5 d。其中,每組10只雞用來統(tǒng)計(jì)死亡情況，每天觀察各組雛雞狀態(tài)并進(jìn)行記錄。每組另外20只雞采集泄殖腔棉拭子進(jìn)行排毒情況檢測，采集脾臟、法氏囊及胸腺3種免疫器官進(jìn)行免疫器官指數(shù)測定及基因表達(dá)情況檢測。

1.3 病毒滴度測定選取9日齡雞胚分離原代肝臟細(xì)胞，用排槍將消化好并且混勻的100 μL細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，進(jìn)行10倍梯度接毒，病毒選用本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化的血清4型禽腺病毒，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，根據(jù)Reed -Muench方法計(jì)算毒株的TCID50。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)合成Fadv引物[15]、管家基因β-actin及目的基因IRF-7、2′-5′OAS、MX1[16]、IFN-γ[17]、IL-6[18]及TNF-α[19]引物，經(jīng)Blast驗(yàn)證，初步判定引物具有較好的特異性。引物凍干品由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用前用DEPC處理的滅菌超純水稀釋為10 μmol/L的濃度，分裝后于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品核酸提取棉拭子病毒DNA使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA Extraction Kit提取病毒核酸，免疫器官總RNA用TRIzol法進(jìn)行提取。

1.6 反轉(zhuǎn)錄及qPCR反轉(zhuǎn)錄過程參照東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的說明書操作，qPCR體系參照東洋紡SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad prism 7.0軟件繪制圖。數(shù)據(jù)的分析運(yùn)用ANOVA單因素分析和LSD假定方差齊性分析來進(jìn)行各試驗(yàn)組之間的差異性比較，并以P<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組雛雞死亡情況比較分析結(jié)果對(duì)3個(gè)組的雛雞死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)攻毒組都是在攻毒后4 d開始出現(xiàn)死亡，攻毒后5 d達(dá)到死亡高峰，F(xiàn)adv-4+FLO組在攻毒后7 d雛雞全部死亡，F(xiàn)adv-4組最后仍有20%的存活率，對(duì)照組全程無死亡情況(圖1A)。對(duì)每天的病死率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)adv-4+FLO組每天的病死率基本都顯著高于Fadv-4組(圖1B)。

A.不同組雛雞生存曲線；B.攻毒雛雞病死率。*.P<0.05； **.P<0.01；***.P<0.001。下同

2.2 泄殖腔排毒情況監(jiān)測結(jié)果在攻毒后1～5 d采集2個(gè)攻毒組的泄殖腔棉拭子，用qPCR方法對(duì)2個(gè)攻毒組的排毒情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在攻毒后1～3 d Fadv-4+FLO組的排毒量略低于Fadv-4組，但差異不顯著；攻毒后 4，5 d，即死亡高峰期時(shí)，F(xiàn)adv-4+FLO組的排毒量開始高于Fadv-4組，差異也不顯著(圖2)。

2.3 病理學(xué)變化攻毒后5 d對(duì)不同組雛雞進(jìn)行剖檢觀察，可見Fadv-4組(圖3A，B)及Fadv-4+FLO組(圖3D，E)均具有典型的血清4型禽腺病毒感染病變，表現(xiàn)為心包積液及肝臟變性腫脹及出血病變；肝臟組織切片可見肝臟細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒變性和空泡變性，多見灶狀壞死，并見大量淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞核內(nèi)有嗜酸性或嗜堿性包涵體(圖3C，F(xiàn))，并且Fadv-4+FLO組的病變更加嚴(yán)重。

圖2 排毒情況

A～C.Fadv-4組雛雞剖檢及肝臟鏡檢病變；D～F.Fadv-4+FLO組雛雞剖檢及肝臟鏡檢病變

2.4 免疫器官指數(shù)比較結(jié)果對(duì)不同處理組脾臟、法氏囊及胸腺等3種免疫器官的器官指數(shù)進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)2個(gè)攻毒組的脾臟器官指數(shù)在攻毒后3 d略低于對(duì)照組，但差異不顯著；攻毒后5，7 d，2個(gè)攻毒組的脾臟器官指數(shù)均高于對(duì)照組，但是Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組(圖4A)。2個(gè)攻毒組的法氏囊器官指數(shù)在攻毒后3 d略高于對(duì)照組，在攻毒后5，7 d，2個(gè)攻毒組顯著低于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組，但差異不顯著(圖4B)。2個(gè)攻毒組的胸腺器官指數(shù)均低于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組，且在攻毒后7 d時(shí)差異顯著(圖4C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

2.5 干擾素相關(guān)基因表達(dá)情況比較分析結(jié)果用qRT-PCR的方法對(duì)攻毒后5 d 3種免疫器官中的干擾素相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果顯示在脾臟中Fadv-4+FLO組的IRF-7的表達(dá)量顯著低于Fadv-4組及對(duì)照組，2個(gè)攻毒組2′-5′OAS及MX1的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組(圖5A)；在法氏囊中IRF-7的表達(dá)量3個(gè)組無明顯差異，2個(gè)攻毒組2′-5′OAS及MX1的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組(圖5B)；在胸腺中2個(gè)攻毒組IRF-7、2′-5′OAS及MX1的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組IRF-7及2′-5′OAS表達(dá)量顯著低于Fadv-4組(圖5C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

2.6 細(xì)胞因子基因表達(dá)情況比較分析結(jié)果對(duì)攻毒后5 d 3種免疫器官中的細(xì)胞因子基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果顯示在脾臟中2個(gè)攻毒組IL-6及IFN-γ的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組，3個(gè)組中TNF-α的表達(dá)量無明顯差異(圖6A)；在法氏囊中2個(gè)攻毒組IL-6、IFN-γ及TNF-α的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組(圖6B)；在胸腺中2個(gè)攻毒組IL-6及IFN-γ的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并且Fadv-4+FLO組IL-6及TNF-α的表達(dá)量均顯著低于Fadv-4組(圖6C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

3 討論

近年來，隨著FLO在獸醫(yī)臨床及水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，尤其是作為開口藥被大量用于家禽養(yǎng)殖。關(guān)于FLO毒副作用的研究報(bào)道也越來越多[1,20-22]，尤其是FLO的免疫毒性被高度關(guān)注[23-25]。但是FLO導(dǎo)致的免疫抑制對(duì)于病毒感染的影響尚未見報(bào)道。2015年開始，HPS的病例在中國不斷出現(xiàn)，呈現(xiàn)大面積暴發(fā)[26-28]，禽腺病毒感染已成為養(yǎng)禽業(yè)中日益嚴(yán)重的問題。本試驗(yàn)通過構(gòu)建血清4型禽腺病毒雛雞感染模型，并模擬FLO的臨床用藥，通過檢測相關(guān)指標(biāo)探討FLO用藥對(duì)感染禽腺病毒雛雞病情的影響。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛雞感染Fadv-4后同時(shí)使用FLO可以顯著增加雛雞死亡率，通過監(jiān)測感染后1～5 d的排毒情況，發(fā)現(xiàn)用藥組的排毒量要高于只感染組，并且剖檢病變也更加嚴(yán)重。孫芹芹[15]研究發(fā)現(xiàn)，感染Fadv-4組的雛雞脾臟器官指數(shù)高于對(duì)照組，而胸腺及法氏囊器官指數(shù)則低于對(duì)照組，本試驗(yàn)結(jié)果與其報(bào)道相似，并且本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fadv-4+FLO組的3種免疫器官指數(shù)均低于Fadv-4組，可能與FLO所導(dǎo)致的免疫抑制有關(guān)[29-30]，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

病毒侵入機(jī)體后，通過誘導(dǎo)Ⅰ和Ⅲ型IFNs激發(fā)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生成百上千種ISGs，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用。ISGs所表達(dá)的蛋白不僅能夠直接抑制病毒的復(fù)制，而且能夠反饋調(diào)節(jié)IFNs的表達(dá)量間接發(fā)揮抗病毒作用[31]。許多病毒刺激Ⅰ型IFN系統(tǒng)，激發(fā)數(shù)以百計(jì)的干擾素誘導(dǎo)基因如2′-5′OAS、MX1和PKR以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如IRF-7轉(zhuǎn)錄。據(jù)報(bào)道，雛雞感染Fadv-4可以使IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平顯著升高[32]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LO用藥組免疫器官中干擾素誘導(dǎo)基因IRF-7、2′-5′OAS及MX1和細(xì)胞因子基因IL6、IFN-γ及TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于只攻毒組。推測用藥組的雛雞高死亡率以及排毒量的增加可能與用藥組抑制了相關(guān)干擾素及細(xì)胞因子基因的表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)通過對(duì)FLO用藥組與攻毒組的臨床相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)雛雞應(yīng)用FLO會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的發(fā)病情況，提示臨床雛禽應(yīng)用FLO時(shí)如果有病毒感染的情況，可能會(huì)促進(jìn)相關(guān)病毒病的發(fā)生，因此在臨床用藥時(shí)應(yīng)充分考慮FLO的免疫抑制作用。本研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了FLO的毒副作用，為臨床合理用藥提供了相關(guān)數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步對(duì)該藥物毒副作用的研究奠定基礎(chǔ)。