外泌體介導(dǎo)PCV2通過Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信號通路誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IL-10

段滇寧，李 鳳，方婷婷，林毓婷，朱艷妍，楊小燕 ,2*，陳洪博,2*

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 364012)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病因，受PMWS影響的仔豬更容易與其他疾病出現(xiàn)混合感染，如豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病和豬瘟等[1-3]，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅。越來越多的研究表明，PCV2是一種免疫抑制病毒，可抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，并導(dǎo)致淋巴小結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞凋亡，造成淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失[4-5]，使機(jī)體呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)。研究表明，PCV2感染可提高IL-10的表達(dá)量，IL-10是一種Th2型細(xì)胞因子，由活化的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌，能夠抑制Th1細(xì)胞的IL-2和IFN-γ的合成，誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制[6-7]。機(jī)體內(nèi)IL-10表達(dá)量升高具有有效的抗炎活性，能降低機(jī)體對病毒清除能力[8]。

對PCV2感染的仔豬血清檢測發(fā)現(xiàn)，IL-10水平顯著升高，IL-10表達(dá)升高主要與T細(xì)胞有關(guān)，但與B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞關(guān)系不大。在淋巴組織中IL-10的表達(dá)主要集中在T細(xì)胞區(qū)域，而在B細(xì)胞區(qū)域較少表達(dá)，如下頜淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體，在PCV2感染的細(xì)胞中表達(dá)量低[9]。PCV2的靶細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞等，那么PCV2是如何誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-10呢，其中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本試驗擬以感染PCV2的PK-15細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體為研究對象，研究其對體外培養(yǎng)的仔豬淋巴細(xì)胞分泌IL-10的影響及其調(diào)控的信號通路，探討PCV2引起仔豬免疫抑制的機(jī)制，為PCV2發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路，并為PCV2防控尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒PK-15 細(xì)胞系(無PCV污染)和PCV2-SH(AY686763，病毒滴度為1×10-5.5TCID50/mL),由本實驗室保存。

1.2 主要試劑兔抗PCV2 Cap多克隆抗體、兔抗NF-кB /p65多克隆抗體、兔抗CD81多克隆抗體和兔抗β-actin多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗TSG101多克隆抗體購自Sigma公司；兔抗磷酸化抑制性核因子кBα(p-IкBα)多克隆抗體購自美國Enzo Life Sciences公司；兔抗MyD88單克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗兔IgG-FITC、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒、兔抗組蛋白3(Histone H3)多克隆抗體、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒和化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒均購自上海碧云天生物公司；豬特異性IL-10 ELISA 試劑盒購自上海西唐生物科技股份有限公司；豬淋巴細(xì)胞分離液購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)3頭經(jīng)檢測PCV2抗原陰性的35日齡斷奶仔豬，頸靜脈放血致死，無菌采集新鮮脾臟，去除表面血污及纖維組織，機(jī)械法剝離脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾分離細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀與淋巴細(xì)胞分離液=1∶1混勻，室溫水平轉(zhuǎn)子800 r/min離心30 min，小心吸取血漿層與分離液層中間的細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入10% 1640培養(yǎng)基，室溫水平轉(zhuǎn)子250 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次，用10%的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h除去單核巨噬細(xì)胞，收集上清液即為淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL備用。

1.4 外泌體(Exo)的提取當(dāng)生長良好的PK-15細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，將PCV2-SH按MOI=1.0接種PK-15細(xì)胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱中感染2 h后，換為用無外泌體血清配置的2%維持液，48 h后收集細(xì)胞上清液，提取外泌體，即為P-Exo。按照試劑盒說明書操作如下：4℃、2 000 r/min離心30 min去除死細(xì)胞，10 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，上清液用0.22 μm濾器過濾去除微囊泡；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，按照體積比Exosomes Concentration Solution試劑∶細(xì)胞上清液=1∶4加入，旋渦振蕩充分混勻，于4℃靜置2 h；將混合液10 000 r/min離心60 min，收集沉淀，用PBS充分混勻；將混懸液12 000 r/min離心30 min，上清液即富含外泌體顆粒；外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosomes Purification Filter中，3 000 r/min離心10 min，收集管底濾液即為P-Exo，純化后的P-Exo -80℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取未接毒PK-15細(xì)胞外泌體，標(biāo)記為N-Exo。將外泌體樣本與RIPA裂解液按體積比1∶1混勻，置于冰上裂解10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清即為外泌體裂解組；BCA法測定外泌體濃度。

1.5 透射電鏡觀察將外泌體滴在2 mm銅網(wǎng)片上，用濾紙沿銅網(wǎng)片邊緣輕輕擦拭，吸收多余水分。樣品在室溫下用醋酸雙氧鈾溶液染色5 min，干燥10 min，在80 kV下用透射電鏡觀察樣品形態(tài)。

1.6 試驗設(shè)計將淋巴細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別是空白對照組、外泌體組(N-Exo)、PCV2組、PCV2外泌體組(P-Exo)、P-Exo裂解組(P-Exo lysis)和P-Exo 抑制劑組(P-Exo-BAY)?？瞻讓φ战M為正常分離的淋巴細(xì)胞；N-Exo組接種N-Exo質(zhì)量濃度為5.0 mg/L；PCV2組接種PCV2病毒MOI=1.0；P-Exo 組接種P-Exo質(zhì)量濃度為5.0 mg/L；P-Exo lysis組將P-Exo超聲波破碎后再孵育淋巴細(xì)胞；P-Exo-BAY組細(xì)胞鋪板2 h后加入NF-κB抑制劑BAY 11-7082(終濃度50 mmol/L)，孵育2 h后換成新的細(xì)胞培養(yǎng)液，再接種P-Exo質(zhì)量濃度為5.0 mg/L；培養(yǎng)24 h后收獲淋巴細(xì)胞和細(xì)胞上清液用于后續(xù)試驗。

1.7 間接免疫熒光檢測PCV2感染淋巴細(xì)胞取空白對照組、PCV2組和P-Exo組淋巴細(xì)胞置于黏附劑載玻片上，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，0.5% TritonX-100室溫20 min；PBS洗滌3次，5% BSA在37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中1 h；PBS洗滌3次，加入PCV2 Cap多克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育 2 h;PBS洗滌3次，加入IgG-FITC熒光二抗(1∶200稀釋)，37℃孵育1 h;DAPI 室溫染藍(lán)30 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.8 qPCR檢測淋巴細(xì)胞TLRs mRNA變化 使用TRIzol方法提取淋巴細(xì)胞總RNA，根據(jù)說明書使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR反應(yīng)體系由2 μL cDNA、10 μL SYBR Green、0.6 μL 上游引物、0.6 μL下游引物和6.8 μL雙蒸餾水組成。以β-actin為內(nèi)參，檢測TLRs mRNA變化，引物序列見表1。

表1 TLRs和內(nèi)參基因的引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.9 ELISA檢測IL-10表達(dá)量將淋巴細(xì)胞分4組，分別加入終質(zhì)量濃度為0,2.5,5.0,10.0 mg/L的P-Exo，于24,48 h后收集細(xì)胞上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量。通過試驗確定外泌體的質(zhì)量濃度為5.0 mg/L,檢測時間點為24 h。

1.10 Western blot檢測NF-κB/p65、p-IκB和My-D88蛋白含量用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取淋巴細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，具體步驟參考文獻(xiàn)[10]。將細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白分別與5× SDS變性緩沖液混合煮沸5 min，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜，在37℃溫箱中5%脫脂乳封閉2 h后，在4℃冰箱孵育一抗(NF-кB /p65、p-IкBα、MyD88、Histone H3和β-actin，1∶1 000稀釋)過夜，室溫孵育二抗2 h，用ECL顯影液檢測，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)和太小，結(jié)果如圖1A所示，提取的外泌體為杯狀小囊泡，雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，直徑為50～150 nm，大小不一。為進(jìn)一步鑒定提取的外泌體，采用Western blot法檢測外泌體的標(biāo)志蛋白CD81和TSG101，結(jié)果如圖1B所示，在不同來源外泌體中檢測到目的條帶，表明試驗中成功提取外泌體。

A.透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)；B.Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白

2.2 PCV2感染PK-15細(xì)胞的外泌體鑒定將提取的外泌體進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果如圖2所示，在P-Exo和PCV2感染的PK-15細(xì)胞中可以檢測到PCV2 Cap蛋白，正常PK-15細(xì)胞及其分泌的外泌體中不含Cap蛋白，表明P-Exo中含有病毒粒子成分。

圖2 Western blot鑒定外泌體

2.3 P-Exo對淋巴細(xì)胞的感染率間接免疫熒光法檢測P-Exo對淋巴細(xì)胞的感染率結(jié)果如圖3所示，PCV2 Cap蛋白染成綠色，細(xì)胞核染成藍(lán)色；在對照組中無陽性信號出現(xiàn)，在PCV2組和P-Exo組中檢測到陽性信號，主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，P-Exo組淋巴細(xì)胞陽性信號明顯多于PCV2組，表明外泌體在PCV2感染淋巴細(xì)胞中起重要作用。

圖3 P-Exo感染仔豬淋巴細(xì)胞(100×)

2.4 P-Exo對淋巴細(xì)胞分泌IL-10的影響將淋巴細(xì)胞分4組，分別加入終質(zhì)量濃度為0.0,2.5,5.0,10.0 mg/L 的P-Exo，于24,48 h后收集細(xì)胞上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，5.0,10.0 mg/L的P-Exo孵育淋巴細(xì)胞24 h后IL-10的含量極顯著升高(P<0.01)，5.0,10.0 mg/L的P-Exo之間無顯著性差異，確定后續(xù)P-Exo的質(zhì)量濃度為5.0 mg/L，檢測時間點為24 h。將PCV2或不同類型外泌體孵育淋巴細(xì)胞后，上清液中IL-10的濃度變化如圖5所示，與對照組相比，PCV2感染淋巴細(xì)胞后IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，P-Exo接種淋巴細(xì)胞后IL-10表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，而正常PK-15細(xì)胞分泌的外泌體或P-Exo lysis對IL-10表達(dá)無明顯作用;淋巴細(xì)胞先孵育BAY 11-7082再接種P-Exo時，IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與PCV2組和抑制劑相比，P-Exo組IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05);結(jié)果表明P-Exo能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-10。

圖4 不同質(zhì)量濃度P-Exo對淋巴細(xì)胞分泌IL-10的影響

圖5 不同刺激物對淋巴細(xì)胞IL-10分泌作用

2.5 P-Exo對淋巴細(xì)胞TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄的影響P-Exo感染淋巴細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞TLRs mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化如圖6所示。與對照組相比，P-Exo inhibitor組TLR2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，PCV2組TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與對照組相比，Exo組、P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.01)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.01)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。試驗結(jié)果表明， P-Exo主要改變Toll7/8/9 mRNA的表達(dá)。

2.6 P-Exo對淋巴細(xì)胞胞漿MyD88、p-IκBα和NF-κB/p65蛋白的影響P-Exo對淋巴細(xì)胞胞漿中MyD88、p-IκBα和NF-κB /p65蛋白的影響如圖7所示。MyD88蛋白水平與對照組相比，Exo組無顯著變化，PCV2組、P-Exo組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組顯著升高，以P-Exo組升高最顯著；p-IκBα蛋白水平與對照組相比，Exo組和PCV2組無顯著變化，P-Exo組顯著升高，P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組表達(dá)有降低趨勢，NF-κB /p65抑制劑能夠降低p-IκBα蛋白表達(dá)；NF-κB /p65蛋白水平與對照組相比，Exo組無顯著變化，PCV2組、P-Exo組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組呈降低趨勢，以P-Exo組降低最顯著。試驗結(jié)果表明，P-Exo能提高胞漿中MyD88表達(dá)，而NF-κB抑制劑對此無影響；P-Exo能促進(jìn)IκBα的磷酸化過程，而NF-κB抑制劑能阻斷P-Exo對IκBα的磷酸化；P-Exo降低胞漿中NF-κB /p65含量，促進(jìn)其入核。

2.7 P-Exo對淋巴細(xì)胞胞核NF-κB/p65蛋白的影響P-Exo對淋巴細(xì)胞胞核NF-κB /p65蛋白的影響如圖8所示。與對照組相比，Exo組、PCV2組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組無顯著變化，P-Exo組顯著升高。試驗結(jié)果表明，P-Exo能促進(jìn)NF-κB/p65入核，p-IκBα磷酸化過程被抑制后，NF-κB/p65入核減少。

圖6 P-Exo對仔豬淋巴細(xì)胞中TLRs mRNA表達(dá)量的影響

圖7 不同刺激物對淋巴細(xì)胞漿蛋白的影響

圖8 不同刺激物對淋巴細(xì)胞核蛋白的影響

3 討論

外泌體(exosomes，Exo)是由活細(xì)胞分泌而來的微小囊泡，直徑為30～200 nm，浮密度為1.13～1.21 g/mL，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)容物比較復(fù)雜，包含了mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)，甚至細(xì)胞器；外泌體可通過細(xì)胞膜受體直接激活受體細(xì)胞，也可運(yùn)輸內(nèi)容物進(jìn)入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊。此外，許多病毒感染的細(xì)胞分泌的外泌體與正常細(xì)胞分泌的外體含量不同，它們也可能包含各種病毒蛋白、RNAs，甚至病毒粒子，因此病毒有可能利用外泌體進(jìn)行傳播并感染靶細(xì)胞[11-12]。近年來的研究表明，外泌體在HIV-1、HCV、HAV和DENV等幾種病毒的傳輸中起重要作用，從HCV或HAV感染細(xì)胞中分離的外泌體被證明含有完整的病毒顆粒，并且能夠?qū)⒏腥緜鞑ソo其他細(xì)胞[13]。研究顯示，PRRSV感染細(xì)胞分泌的外泌體中含有M、N和GP5等結(jié)構(gòu)蛋白，不含GP4蛋白[14]。在本研究中，我們成功提取了PK-15細(xì)胞分泌的外泌體，其形態(tài)、大小及其標(biāo)志蛋白質(zhì)CD81、TSG101都符合外泌體的特征。更重要的是P-Exo中包含PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白，在正常PK-15細(xì)胞外泌體中不含有Cap蛋白，而PCV2 Cap 蛋白是上調(diào)豬肺泡巨噬細(xì)胞中 IL-10 表達(dá)的關(guān)鍵組分[15]。進(jìn)一步用P-Exo感染淋巴細(xì)胞，IFA結(jié)果顯示在淋巴細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的陽性信號，且與PCV2組相比，陽性信號增多，表明外泌體在PCV2感染淋巴細(xì)胞中起重要作用。

PCV2特征是病毒粒子無囊膜，基因組為環(huán)狀、閉合、單股的DNA，直徑17～20 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，PCV2粒子在CsCL中的浮密度為1.37 g/mL。PCV2基因組含有11個潛在開放閱讀框(ORF)即ORF 1～11，其中ORF1編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep和Rep′)，ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白；PCV2感染可引起機(jī)體免疫抑制，導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡紊亂，易于感染其他疾病[16]。IL-10是一種由Th2細(xì)胞分泌，作為重要的免疫抑制性細(xì)胞因子能夠抑制Th1細(xì)胞合成IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子。前期研究表明，IL-10通過抑制機(jī)體免疫反應(yīng)促進(jìn)病毒復(fù)制[17]。仔豬感染PCV2后組織中IL-10的表達(dá)量顯著上調(diào)[9,18]，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，PCV2誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-10作用不顯著，這與KEKARAINEN等[19]研究報告相一致，表明PCV2可能不直接影響淋巴細(xì)胞。本試驗結(jié)果表明，P-Exo能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-10，與單獨PCV2感染淋巴細(xì)胞相比，IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；而將P-Exo裂解后再孵育淋巴細(xì)胞，則IL-10的表達(dá)量顯著降低，抑制劑BAY 11-7082降低 NF-κB /p65含量后IL-10的表達(dá)量顯著降低，表明P-Exo可通過NF-κB通路影響IL-10的表達(dá)。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLRs的主要信號途徑包括MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑，除TLR3外大多數(shù)TLRs介導(dǎo)的通路屬于MyD88依賴途徑。TLRs能夠促使IκB磷酸化而降解，IκB與NF-κB解離，游離的NF-κB入核啟動相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[20]。Toll3/7/8/9定位于細(xì)胞內(nèi)膜上，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和內(nèi)含體等，可以識別在細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸物質(zhì)，如雙鏈RNA、單鏈RNA和一些DNA病毒的雙鏈RNA中間產(chǎn)物；Toll2/4位于細(xì)胞膜上，主要識別一些病毒的包被蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，PCV2可改變巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和PK-15細(xì)胞中TLRs的表達(dá)[21-23]。本試驗結(jié)果表明，P-Exo感染淋巴細(xì)胞后，可顯著提高淋巴細(xì)胞Toll7/8/9 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，提高淋巴細(xì)胞Toll3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而對Toll2/4 mRNA的表達(dá)無顯著作用。PCV2直接感染則主要影響Toll2/4/9 mRNA的表達(dá)；P-Exo破膜后再感染淋巴細(xì)胞則對淋巴細(xì)胞中Toll3/7/8/9 mRNA的表達(dá)無顯著性影響；抑制劑BAY 11-7082孵育淋巴細(xì)胞后，用P-Exo感染淋巴細(xì)胞對其Toll3/7/8/9 mRNA的表達(dá)也無顯著性影響。

IL-10表達(dá)過程中NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起重要作用[24]。DU等[15]研究表明PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)IκB磷酸化，促進(jìn)且NF-κB/p50入核，而p65則無明顯變化。Western blot結(jié)果顯示，P-Exo能夠顯著升高淋巴細(xì)胞胞漿MyD88和p-IκBα蛋白含量，降低胞漿NF-κB /p65的含量，升高細(xì)胞核NF-κB/p65的含量；NF-κB /p65抑制劑BAY 11-7 082能夠顯著下調(diào)胞漿中IκB的磷酸化，抑制NF-κB入核，降低IL-10的表達(dá)。

PCV2感染PK-15細(xì)胞分泌的外泌體包含PCV2 Cap蛋白，外泌體可提高PCV2對淋巴細(xì)胞的感染率，通過Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信號通路促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-10。