高表達(dá)線粒體融合蛋白2(MFN2)可抑制高BHBA活化的奶牛肝細(xì)胞NF-κB炎性通路

左冉坤，遲 良，董記紅，李心慰，王 哲，劉國文，劉煥奇*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062)

圍產(chǎn)期(通常是指產(chǎn)前3周和產(chǎn)后3周)是奶牛泌乳周期中非常關(guān)鍵的一個時期。產(chǎn)后奶牛由于干物質(zhì)攝入減少，泌乳啟動，導(dǎo)致能量需求增加，使奶牛機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，進(jìn)而動員脂肪，脂肪分解增加，導(dǎo)致高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)血癥。當(dāng)肝細(xì)胞吸收大量NEFA，超過了自身代謝能力時，可造成NEFA不完全被氧化，產(chǎn)生大量酮體，如β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，BHBA)、乙酰乙酸和丙酮，造成酮病的發(fā)生[1]。研究表明，酮病奶牛肝臟炎性水平顯著增加，肝臟NF-κB炎性通路顯著激活，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β等濃度顯著升高[2-3]，與酮病奶牛的高BHBA血癥密切相關(guān)。

線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)，是定位于線粒體外膜的高度保守的GTP酶，能參與線粒體外膜的融合，對線粒體功能的發(fā)揮起著重要的作用[4-6]。而線粒體是脂肪酸氧化的主要場所[7-8]，并且線粒體的功能與NF-κB通路的活化有關(guān)[9]，然而，MFN2對奶牛肝細(xì)胞NF-κB通路的影響尚未見報道。因此，本研究采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測NF-κB炎性通路關(guān)鍵分子的蛋白和基因表達(dá)，探討高表達(dá)MFN2對高BHBA活化的NF-κB通路的影響，為奶牛酮病臨床病理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑雙抗(青鏈霉素)、Tris和地塞米松均購自Sigma公司；胎牛血清和RPMI-1640購自Gibco公司；Trizol和Premix Ex-Taq購自TaKaRa公司。

1.2 奶牛肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)采用兩步灌流法分離原代肝細(xì)胞[10]。手術(shù)切除荷斯坦?fàn)倥８挝矤钊~，用灌流液A (140 mmol/L NaCl,10 mmol/L HEPES,6.7 mmol/L KCl,0.5 mmol/L EDTA,2.5 mmol/L 葡萄糖;pH7.2～7.4,37℃)灌注肝臟12 min，流速為50 mL/min。然后用灌流液B (140 mmol/L NaCl,30 mmol/L HEPES,6.7 mmol/L KCl,5 mmol/L CaCl2,2.5 mmol/L 葡萄糖;pH7.2～7.4,37℃)灌注肝臟3 min，流速50 mL/min，直至液體澄清。隨后，以20 mL/min的流速用膠原酶Ⅳ溶液(0.1 g膠原酶Ⅳ溶解在0.5 L灌注溶液B中，pH7.2～7.4，37℃)消化肝臟15～20 min。消化后將肝臟放入無菌平板中，加入100 mL胎牛血清終止消化。切開肝臟后取出血管和結(jié)締組織，用100目和200目的細(xì)胞篩依次過濾，得到單個肝細(xì)胞。在六孔板中培養(yǎng)72 h后，換成含有不同濃度BHBA(0.0，1.2，2.4，4.8 mmol/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染腺病毒空載體(Ad-GFP)或MFN2過表達(dá)腺病毒(Ad-MFN2)，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7 h后，換成生長培養(yǎng)基培養(yǎng)41 h。

1.3 蛋白的提取和Western blot收集六孔板上的細(xì)胞，加入適量(由細(xì)胞量決定)的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，按照蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物科技有限公司)說明書測定蛋白濃度。用15%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜在3%BSA/Tris緩沖鹽水/Tween(TBS-T)緩沖液中常溫封閉4 h，再分別將膜放在IKBα、p-IKB、NF-κB p65、p-NF-κB p65和MFN2的一抗中孵育過夜，隨后用TBS-T清洗膜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠免疫球蛋白室溫孵育45 min，使用Protein Simple成像儀對條帶成像。

1.4 總RNA提取和實時熒光定量PCR根據(jù)說明書使用TRIzol收集細(xì)胞，總RNA提取試劑盒提取總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成cDNA。利用TaKaRa熒光定量試劑Premix Ex Taq和7500 Real-time PCR System檢測IL-1β、IL-6、TNFα和MFN2的mRNA水平。反應(yīng)條件：94℃初始變性2 min，擴(kuò)增35個循環(huán)(94℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s)，然后在72℃下延伸5 min。用ABI PRISM 7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量PCR,使用2-△Ct法進(jìn)行計算。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度BHBA對奶牛肝細(xì)胞NF-κB炎性通路的影響奶牛肝細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的BHBA刺激后，檢測NF-κB炎性通路相關(guān)蛋白(IKBα、p-IKBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65)和炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNFα)mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，隨著BHBA濃度的增加，p-IKBα和p-NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)量顯著增加(圖1A，B，C)，IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA水平顯著升高(圖1D，E,F)，表明BHBA可激活奶牛肝細(xì)胞NF-κB炎性通路。

A.NF-κB炎性通路相關(guān)蛋白的表達(dá);B.p-IKBα/IKBα;C.p-NF-κB p65/NF-κB p65;D.IL-1β的mRNA表達(dá);E.IL-6的mRNA表達(dá);F.TNFα的mRNA表達(dá)

2.2 不同濃度BHBA對MFN2表達(dá)的影響不同濃度BHBA刺激牛肝細(xì)胞后，檢測MFN2的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，來判定不同濃度的BHBA對奶牛肝細(xì)胞MFN2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，MFN2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平隨著BHBA的濃度的增加而顯著降低，表明BHBA在體外會降低奶牛肝細(xì)胞MFN2的表達(dá)水平(圖2A，B，C)。

A.MFN2 mRNA的表達(dá);B.MFN2蛋白的表達(dá);C.MFN2/β-actin

2.3 過表達(dá)MFN2后細(xì)胞內(nèi)MFN2的變化采用MFN2過表達(dá)腺病毒(Ad-MFN2)轉(zhuǎn)染奶牛肝細(xì)胞，檢測MFN2過表達(dá)情況。結(jié)果顯示， Ad-MFN2處理組與Ad-GFP處理組相比，MFN2的mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高，AD-MFN2+BHBA處理組MFN2的mRNA和蛋白表達(dá)量也顯著高于Ad-GFP+BHBA處理組(圖3A，B，C)，這表明MFN2在奶牛肝細(xì)胞內(nèi)成功過表達(dá)，能逆轉(zhuǎn)BHBA對MFN2表達(dá)的抑制作用。

2.4 過表達(dá)MFN2對BHBA活化的NF-κB炎性通路的影響采用腺病毒過表達(dá)MFN2后，檢測IKBα、p-IKBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)量，以及IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Ad-GFP處理組相比，Ad-MFN2處理組p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著降低(圖4A，C)，IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達(dá)水平也顯著降低(圖4D,E,F)。而Ad-MFN2 + BHBA處理組的p-IKBα和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平與Ad-GFP + BHBA處理組相比顯著降低(圖4A，B，C)，IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達(dá)水平相比也顯著低于Ad-GFP+BHBA處理組(圖4D,E,F)。結(jié)果表明，過表達(dá)MFN2可抑制奶牛肝細(xì)胞BHBA引起的NF-κB炎性通路活化。

A.MFN2的mRNA表達(dá);B.MFN2的蛋白表達(dá);C.MFN2/β-actin

A.NF-κB炎性通路相關(guān)蛋白的表達(dá);B.p-IKBα/IKBα;C.p-NF-κB p65/NF-κB p65;D.IL-1β mRNA的表達(dá);E.IL-6 mRNA的表達(dá);F.TNFα mRNA的表達(dá)

3 討論

奶牛酮病是圍產(chǎn)期奶牛常發(fā)的一種代謝性疾病，圍產(chǎn)期奶牛干物質(zhì)攝入減少，能量需求增加，導(dǎo)致脂肪動員，致使奶牛體內(nèi)堆積大量酮體，引發(fā)代謝障礙而產(chǎn)生酮病[11-12]。酮病奶牛表現(xiàn)出高NEFA和高BHBA血癥[13]，并且存在系統(tǒng)性的非感染性炎癥，血液中炎性細(xì)胞因子TNF和IL-6水平顯著升高[14]。NF-κB和NLRP3炎性通路是調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)通路，而奶牛酮病的發(fā)病過程中肝臟NF-κB和NLRP3信號通路過度的活化[3]，所以NF-κB和NLRP3介導(dǎo)的炎性因子的升高與NEFA和BHBA的升高相關(guān)。史曉霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，體外添加NEFA處理奶牛原代肝細(xì)胞，可以促進(jìn)NF-κB炎性通路的活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的合成。本試驗結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)的奶牛肝細(xì)胞中添加高濃度的BHBA會促進(jìn)NF-κB相關(guān)蛋白及炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β) mRNA的表達(dá)，能量負(fù)平衡產(chǎn)生的高BHBA和NEFA血癥可激活肝細(xì)胞NF-κB炎性通路的活化，加劇酮病的發(fā)生和發(fā)展。

MFN2是線粒體膜上的蛋白，它可以參與線粒體融合，當(dāng)其表達(dá)受到抑制時，會損害線粒體的功能[16]。在患有非酒精性脂肪肝炎的人和奶牛肝臟內(nèi)均出現(xiàn)線粒體功能障礙，MFN2蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低[16-17]。DONG等[18]研究發(fā)現(xiàn),脂肪肝奶牛肝臟MFN2表達(dá)水平顯著降低。所以MFN2的表達(dá)降低可能與高濃度BHBA的脂毒性有關(guān)，MFN2的低表達(dá)可能參與了奶牛肝臟炎性通路的活化和肝臟能量代謝紊亂的發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，高濃度BHBA可以顯著抑制MFN2基因和蛋白的表達(dá)，這說明高濃度的BHBA可顯著抑制MFN2的表達(dá)，損傷線粒體功能，進(jìn)而可能進(jìn)一步活化炎性信號通路，加劇酮病的產(chǎn)生。

在大鼠肝臟缺血再恢復(fù)灌注造成的炎性損傷中，線粒體損傷隨缺血時間的延長而加重，MFN2蛋白和mRNA的表達(dá)也隨之降低，同時表現(xiàn)出大量的炎性細(xì)胞浸潤[19]，這說明MFN2的表達(dá)與炎性水平有關(guān)。但關(guān)于MFN2的低表達(dá)是否參與了BHBA誘導(dǎo)的NF-κB炎性通路活化尚未見報道。本試驗通過在奶牛肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染腺病毒發(fā)現(xiàn)，MFN2過表達(dá)后，可抑制由BHBA引起的p-NF-κB p65和p-IKBα蛋白及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平升高，表明BHBA誘導(dǎo)的NF-κB炎性通路的活化被過表達(dá)的MFN2顯著抑制，說明MFN2可作為奶牛酮病的治療靶點，通過過表達(dá)MFN2一方面改善肝細(xì)胞線粒體功能，另一方面抑制肝細(xì)胞炎性通路的活化，起到防治酮病病理損傷的作用。

綜上所述，BHBA在體外培養(yǎng)的奶牛肝細(xì)胞中可以誘導(dǎo)NF-κB炎性通路的激活，而過表達(dá)MFN2可以逆轉(zhuǎn)BHBA引起的奶牛肝細(xì)胞炎性通路的激活，提示MFN2有望成為圍產(chǎn)期奶牛酮病疾病治療靶點。