年齡差異對(duì)家兔CD4+T細(xì)胞在胃腸分布的影響

火興民，李淑賢，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

作為與外部環(huán)境接觸最為密切的機(jī)體內(nèi)表面，胃腸道在承擔(dān)著消化吸收功能的同時(shí)，還要時(shí)刻警惕來源于機(jī)體外部環(huán)境的病原菌入侵，當(dāng)覺察到危險(xiǎn)時(shí)要迅速地做出反應(yīng)發(fā)動(dòng)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)[1]。在黏膜的免疫保護(hù)反應(yīng)中，T細(xì)胞是參與其中的一類重要的免疫細(xì)胞[2]，其中T細(xì)胞亞群中的CD4+T細(xì)胞在維持腸道內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定和保護(hù)腸黏膜免受致病微生物侵害的過程中發(fā)揮主要的作用，這也使得CD4+T細(xì)胞在腸道固有層T細(xì)胞總數(shù)中占比較大，超過了50%以上[3]。T淋巴細(xì)胞依照其組成表面抗原受體的2條異二聚體的不同，可以分類為T細(xì)胞和T細(xì)胞，T細(xì)胞依據(jù)其表面另一類具有在抗原識(shí)別過程中發(fā)揮協(xié)助功能的分子的差異，進(jìn)一步被分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞[4]，CD4分子是單次跨膜的單鏈糖蛋白，通過與專職攝取加工呈遞抗原的細(xì)胞外部MHCⅡ類分子特異性結(jié)合從而參與到TCR對(duì)抗原的識(shí)別的過程中[5]。

CD4+T細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，召集白細(xì)胞抵達(dá)感染和炎癥部位，并且調(diào)動(dòng)其他T細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)功能，以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活性等方面發(fā)揮積極的作用[6]。有研究表明，當(dāng)CD4+T細(xì)胞在腸內(nèi)出現(xiàn)大量聚集的狀態(tài)時(shí)，是炎癥性腸病(IBD)發(fā)生的典型表現(xiàn)之一,這種異常聚集的現(xiàn)象不僅是疾病發(fā)生時(shí)的組織病理表現(xiàn)，同時(shí)也有可能是導(dǎo)致IBD發(fā)生的直接原因[7]。CD4+T細(xì)胞發(fā)揮適度的功能是維持機(jī)體健康的前提，自體防御系統(tǒng)發(fā)生異常而引發(fā)的疾病往往就是因?yàn)榉磻?yīng)過于劇烈造成的不良后果，反應(yīng)太弱則會(huì)面臨感染和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

有學(xué)者對(duì)人和兔腸黏膜相關(guān)淋巴組織(GALT)特征進(jìn)行了研究比較，發(fā)現(xiàn)GALT結(jié)構(gòu)在人與兔之間擁有很高的相似度，因此對(duì)兔消化道黏膜免疫的研究可為人醫(yī)臨床中腸相關(guān)疾病的研究提供可參考的資料[9]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只白兔市購，按不同年齡歸類為幼年組(2月齡)、青年組(6月齡)和老年組(36月齡)，每組5只雌性、5只雄性。

1.2 樣本采集使用0.1 mL/kg戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射后致死白兔，取胃、小腸、大腸并浸泡在固定液中。

1.3 染色切片脫蠟后，依次滴入30% H2O2，0.1% 胰蛋白酶，5% BSA封閉液，一抗Anti-CD4抗體[KEN4](ab194998，Abcam)，二抗驢抗羊IgG(博奧森),SABC試劑，DAB顯色液，之后蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法從各組各部位染色后的切片中任意挑選5個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)挑選10個(gè)視野，計(jì)算單位面積CD4陽性細(xì)胞的數(shù)目。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T細(xì)胞在胃中的分布特征

2.1.1CD4+T細(xì)胞在胃中的定位 大多數(shù)CD4+T細(xì)胞定位在黏膜肌層周圍，胃腺之間偶爾可見分布，但數(shù)量較少(圖1，2)。

A1.為局部放大后CD4+T細(xì)胞在胃底腺區(qū)的分布情況，箭頭所示為CD4+細(xì)胞；A2.陰性對(duì)照

B1.為局部放大后CD4+T細(xì)胞在幽門腺區(qū)的分布情況，箭頭所示為CD4+細(xì)胞；B2.陰性對(duì)照

2.1.2CD4+T細(xì)胞在胃中的數(shù)量變化 胃底腺區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯少于幽門腺區(qū)。各部位的陽性細(xì)胞數(shù)目隨著年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)(表1，圖3)。

表1 胃CD4+ T細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2 CD4+T細(xì)胞在小腸中的分布特征

2.2.1CD4+T細(xì)胞在小腸中的定位 CD4+T細(xì)胞的基本形態(tài)主要為圓形或橢圓形。CD4+T細(xì)胞大多定位于固有層中，且絨毛固有層中分布較多(圖4～6)。

圖3 胃中CD4+ T細(xì)胞數(shù)量隨年齡變化趨勢(shì)

C1,C2.CD4+ T細(xì)胞在十二指腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；C3,C4.陰性對(duì)照

D1,D2.CD4+ T細(xì)胞在空腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；D3,D4.陰性對(duì)照

E1,E2.CD4+ T細(xì)胞在回腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；E3,E4.陰性對(duì)照

2.2.2CD4+T細(xì)胞在小腸中的數(shù)量變化 小腸不同部位CD4+T細(xì)胞數(shù)目無明顯的差異，由十二指腸到回腸表現(xiàn)為小幅遞增。小腸各段的陽性細(xì)胞數(shù)量隨年齡的增長(zhǎng)表現(xiàn)出先增后減的變化趨勢(shì)(表2,圖7)。

表2 小腸CD4+ T細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖7 小腸CD4+ T細(xì)胞數(shù)量隨年齡變化趨勢(shì)

2.3 CD4+T細(xì)胞在大腸中的分布特征

2.3.1CD4+T細(xì)胞在大腸中的定位 CD4+T細(xì)胞主要定位于大腸黏膜固有層中(圖8～10)。

2.3.2CD4+T細(xì)胞在大腸中的數(shù)量變化 大腸不同部位CD4+T細(xì)胞數(shù)量差距不明顯，由前段向后段小幅度遞減。CD4+T細(xì)胞的數(shù)量隨月齡增加表現(xiàn)為先增后減的變化趨勢(shì)，而2月齡組與36月組齡未見明顯差異(表3,圖11)。

F1.陽性細(xì)胞在盲腸的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；F2.陰性對(duì)照

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞在胃底腺區(qū)的定位數(shù)量要明顯低于幽門腺區(qū)。胃底腺區(qū)有大量的主細(xì)胞，由它分泌的鹽酸不僅幫助消化食物，而且還可以殺滅隨著食物進(jìn)入到胃中的病原微生物，同時(shí)胃酸可以在胃底腺區(qū)黏膜表面形成一層屏障，可有效的隔絕病原與黏膜接觸。幽門腺區(qū)缺乏主細(xì)胞，因此是鹽酸形成保護(hù)屏障的非優(yōu)勢(shì)區(qū)域，而食物在經(jīng)過幽門進(jìn)入小腸時(shí)可與黏膜充分接觸，增加了黏膜暴露于有害因子中的風(fēng)險(xiǎn)，所以這一區(qū)域需要較多數(shù)量的CD4+T細(xì)胞參與免疫保護(hù)反應(yīng)，這可能是胃底與幽門部CD4+T細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)差異的原因之一。

G1,G2.CD4+ T細(xì)胞在結(jié)腸不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；G3,G4.陰性對(duì)照

H1,H2.CD4+ T細(xì)胞在回腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細(xì)胞；H3,H4.陰性對(duì)照

表3 大腸CD4+ T細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

CD4+T細(xì)胞在腸道中主要分布于固有層中，固有層是T細(xì)胞發(fā)揮功能的主要部位，效應(yīng)部位的幼稚T細(xì)胞受到抗原刺激后迅速發(fā)生分化和增殖，之后轉(zhuǎn)移到固有層等部位參與保護(hù)反應(yīng)，研究中發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞尤其在腸絨毛固有層中表現(xiàn)聚集性的分布，這與腸絨毛負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收功能而與腸內(nèi)容物緊密接觸相關(guān)，食靡中的病原可能會(huì)對(duì)絨毛上皮完整性造成破壞，所以有較多的T細(xì)胞存在于這一區(qū)域及時(shí)參與免疫保護(hù)。小腸各部分CD4+T細(xì)胞分布數(shù)量的變化與對(duì)大鼠和小鼠的研究結(jié)果吻合，均呈現(xiàn)由小腸前段到后段的小幅度遞增[10]。在腸道中與宿主共同生活的微生物群落與免疫系統(tǒng)息息相關(guān)[11]，它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)的發(fā)育成熟和功能發(fā)揮以及其他調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理功能方面起著直接或間接的作用[12]，據(jù)此猜測(cè)CD4+T細(xì)胞在小腸中呈現(xiàn)如此的分布變化可能與定殖于小腸各部分黏膜表面的微生物群落的數(shù)量有很大程度的關(guān)聯(lián)，而且年齡、飲食等因素也在影響著微生物群落的構(gòu)成[13-14]，從而間接影響CD4+T細(xì)胞的分布，這也是為什么家兔陽性細(xì)胞的分布隨年齡變化出現(xiàn)差異的原因之一。有人對(duì)腸道中的菌群分布特點(diǎn)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，腸道中大多數(shù)的菌群主要定殖于小腸后段和大腸前段，小腸中除了后段以外的其余部分普遍表現(xiàn)出較低的菌群豐度[15]，這一結(jié)果更加印證了先前的猜測(cè)，微生物群落定殖數(shù)量直接影響著CD4+T細(xì)胞分布數(shù)量。此外，資料證實(shí)小腸中巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)由前段到后段表現(xiàn)為逐漸遞增，這與CD4+T細(xì)胞的分布變化特點(diǎn)相同，這是因?yàn)榫奘杉?xì)胞的活力增強(qiáng)受CD4+T細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子的調(diào)控[16]，因此出現(xiàn)了這種相伴分布的狀態(tài)。腸道各部位CD4+T細(xì)胞數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)表現(xiàn)出先增后減的變化趨勢(shì)，和小鼠GALT增齡性變化相符[17]。目前，生理衰老對(duì)CD4+T細(xì)胞表型和功能影響的研究有限，但是衰老在腸黏膜上皮屏障完整性缺失的過程中起到了推動(dòng)作用，同時(shí)也是對(duì)腸道病原微生物防御能力下降的一個(gè)因素，老年動(dòng)物受此影響，遭受疾病侵?jǐn)_的風(fēng)險(xiǎn)增加。

圖10 大腸CD4+ T細(xì)胞數(shù)量隨年齡變化趨勢(shì)