地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔甲狀腺和甲狀旁腺組織的影響

韓 昱，張立永，張富梅，馮宇飛，金圓圓

(1.河北北方學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,河北 張家口 075000)

在家兔養(yǎng)殖過程中，應(yīng)激是造成公兔生殖機(jī)能下降的直接原因之一[1-2]，據(jù)報(bào)道，熱應(yīng)激使公兔甲狀腺的組織結(jié)構(gòu)處于功能低下狀態(tài)，從而影響T3和T4的正常分泌，降低精液品質(zhì)[3-4]。熱應(yīng)激給家兔帶來的不利影響，大大降低了種兔的利用價(jià)值，嚴(yán)重制約了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) 是芽孢桿菌中具有較強(qiáng)應(yīng)用潛力的益生菌之一，在日糧中添加地衣芽孢桿菌可促進(jìn)畜禽的生長[5-7]，改善腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)有益菌的增殖，增強(qiáng)機(jī)體抗熱應(yīng)激能力[8-9]。雖然對熱應(yīng)激的研究報(bào)道較為普遍，但是關(guān)于地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激家兔甲狀腺的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過光鏡和電鏡觀察公兔甲狀腺結(jié)構(gòu)變化，揭示地衣芽孢桿菌在抗熱應(yīng)激中的作用機(jī)理，為生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)飼糧、活菌制劑及試驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼糧原料為玉米38%、麩皮7%、豆粕17%、苜蓿草粉24%、燕麥12%、骨粉1%、其他1%，制成顆粒飼料。營養(yǎng)成分：消化能(DE)11.09 MJ/kg，粗蛋白(CP)17.06%，粗纖維(CF)10.05%。地衣芽孢桿菌活菌制劑的活菌含量為 2×1010CFU/g，購于北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)動(dòng)物為年齡相同、體質(zhì)量3.5～4.5 kg、體況良好的成年塞北兔種公兔。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇18只種公兔，隨機(jī)分為常溫組、熱應(yīng)激對照組和地衣芽孢桿菌試驗(yàn)組，每組6只。常溫組兔舍溫度控制在20～25℃，熱應(yīng)激對照組和地衣芽孢桿菌試驗(yàn)組兔舍溫度模擬炎熱夏季溫度變化，采用全自動(dòng)智能控溫電加熱暖風(fēng)機(jī)調(diào)節(jié)溫度。9:00-12:00溫度控制在26～32℃，12:00-16:00溫度控制在33～35℃，16:00-22:00溫度控制在28～30℃，22:00-3:00溫度控制在26～28℃，凌晨3:00-9:00溫度控制在25～26℃。公兔單籠飼養(yǎng)，常溫組和熱應(yīng)激對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，地衣芽孢桿菌試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+1 000 mg/kg地衣芽孢桿菌(前期試驗(yàn)已完成添加量梯度篩選工作[10])。7 d 預(yù)試期后轉(zhuǎn)為正試期飼喂15 d，保證兔舍的清潔衛(wèi)生，定期消毒。

1.3 測定指標(biāo)與觀察

1.3.1血漿皮質(zhì)醇含量和甲狀腺指數(shù)測定 分別于試驗(yàn)前及試驗(yàn)5,10,15 d采集兔血液，制備血漿，測定血漿皮質(zhì)醇含量(放射免疫法)。在試驗(yàn)期末空腹12 h后測體質(zhì)量，摘取甲狀腺測其質(zhì)量，計(jì)算甲狀腺指數(shù)。

1.3.2光鏡下觀察甲狀腺組織 取1.3.1中部分甲狀腺組織固定于4%甲醛磷酸緩沖液中(pH7.2～7.4)，待充分固定后，按照常規(guī)方法進(jìn)行7次酒精脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，制作切片，HE染色后，采用YD300型數(shù)字?jǐn)z像機(jī)及圖像處理系統(tǒng)分析甲狀腺組織變化情況。

1.3.3透射電鏡觀察甲狀腺細(xì)胞變化 取1.3.1中部分甲狀腺組織，采用2.5%戊二醛固定24 h以上，用磷酸緩沖液漂洗，再用1%餓酸固定，不同濃度的乙醇脫水，然后包埋、固化，做超薄切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，采用JEMCXⅡ型透射式電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔血漿皮質(zhì)醇和甲狀腺指數(shù)的影響

2.1.1地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔血漿皮質(zhì)醇的影響 由表1可知，在試驗(yàn)前測定各組血漿皮質(zhì)醇水平差異均不顯著(P>0.05)。5，10 d熱應(yīng)激對照組和地衣芽孢桿菌組均極顯著高于常溫組(P<0.01)，且熱應(yīng)激對照組高于地衣芽孢桿菌組有顯著性差異(P<0.05)。15 d熱應(yīng)激對照組繼續(xù)下降，但顯著高于地衣芽孢桿菌組(P<0.05)，極顯著高于常溫組(P<0.01)，地衣芽孢桿菌組顯著高于常溫組(P<0.05)。

2.1.2地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔甲狀腺指數(shù)的影響 由表2可知，常溫組、熱應(yīng)激對照組和地衣芽孢桿菌組甲狀腺質(zhì)量和甲狀腺指數(shù)兩兩比較有極顯著性差異 (P<0.01)；熱應(yīng)激公兔甲狀腺質(zhì)量和指數(shù)為常溫組>地衣芽孢桿菌組>熱應(yīng)激對照組。

2.2 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激種公兔甲狀腺組織結(jié)構(gòu)變化的影響結(jié)果見圖1。常溫組在試驗(yàn)15 d、10×10倍光鏡下觀察甲狀腺組織無明顯變化，濾泡形態(tài)呈少量圓形或較多扁橢圓形，濾泡邊緣整齊光滑，直徑20～65 μm，濾泡基膜由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，偏于濾泡基膜處；胞內(nèi)基質(zhì)為嗜酸性染色，基質(zhì)中可見有散在的濾泡上皮細(xì)胞；濾泡旁細(xì)胞分布較廣，存在于濾泡之間或上皮細(xì)胞之間，血管竇清晰可見。熱應(yīng)激對照組濾泡變化較大，濾泡基膜不規(guī)則，有的基膜破裂，分界不明顯，可略見濾泡上皮存在，旁細(xì)胞少而不完整；基膜上皮細(xì)胞核及旁細(xì)胞核溶解，觀察不到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，血管破裂。地衣芽孢桿菌組部分濾泡分界不清，濾泡上皮細(xì)胞較為清晰，旁細(xì)胞較多，血管竇較為清晰可見。

表2 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔甲狀腺指數(shù)的影響

2.3 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果見圖2。試驗(yàn)公兔電鏡下常溫組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞之間通過橋粒連接，細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)常染色質(zhì)較多，且分布均勻，胞質(zhì)中含有豐富的溶酶體、高爾基體和線粒體，線粒體為短桿狀發(fā)育正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較發(fā)達(dá)，含有少量膠質(zhì)小泡。地衣芽孢桿菌組與常溫組比較，細(xì)胞核縮小，細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，且邊集，出現(xiàn)初級(jí)溶酶體，線粒體嵴擴(kuò)張，斷裂，空泡化較為明顯，高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較為發(fā)達(dá)。熱應(yīng)激對照組濾泡上皮細(xì)胞變化顯著，多呈扁平狀，細(xì)胞核萎縮嚴(yán)重，小而扁平，邊緣皺縮，核內(nèi)異染色質(zhì)增多；胞質(zhì)中可見斷裂的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞質(zhì)空泡化較為明顯；少見高爾基體，斑馬體樣溶酶體較多；線粒體嵴斷裂，擴(kuò)張空泡化嚴(yán)重。

A.常溫照;B.地衣芽孢桿菌組;C.熱應(yīng)激組

A.常溫照;B.地衣芽孢桿菌組;C.熱應(yīng)激組

2.4 地衣芽孢桿菌對熱應(yīng)激公兔甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見圖3。常溫組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞胞質(zhì)中線粒體豐富，圓形短桿狀較多，嵴明顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體不發(fā)達(dá)。地衣芽孢桿菌組細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜較為清晰，線粒體嵴輕微擴(kuò)張，可見擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。熱應(yīng)激組嗜酸性細(xì)胞核固縮明顯，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，線粒體嵴斷裂，空泡化程度高，線粒體顆粒增多。

A.常溫組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞；B.地衣芽孢桿菌組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞；C.熱應(yīng)激組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞；D.熱應(yīng)激組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞線粒體基質(zhì)顆粒增多

3 討論

3.1 地衣芽孢桿菌對血漿皮質(zhì)醇和甲狀腺指數(shù)的影響熱應(yīng)激可引起機(jī)體發(fā)生一系列生理反應(yīng)，它通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸系統(tǒng)合成和分泌激素來實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的影響。據(jù)報(bào)道，給大鼠35～38℃持續(xù)熱應(yīng)激能顯著提高大鼠血清皮質(zhì)醇含量，熱應(yīng)激1 d后達(dá)到高峰，以后開始逐漸降低[11]。另據(jù)報(bào)道，長時(shí)間熱應(yīng)激可使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸處于長期亢奮狀態(tài)，功能失常，引起皮質(zhì)醇分泌下降[12]。本試驗(yàn)結(jié)果與前者研究略有區(qū)別，與后者報(bào)道相一致。本試驗(yàn)是模擬夏季高溫對家兔持續(xù)熱應(yīng)激，熱應(yīng)激對照組5 d時(shí)血漿皮質(zhì)醇含量極顯著高于常溫組，且達(dá)到高峰，隨著熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間的延長血漿皮質(zhì)醇含量逐漸降低，到15 d時(shí)略高于常溫組，表明長時(shí)間熱應(yīng)激引起了下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸機(jī)能減退，皮質(zhì)醇合成分泌減少。而飼糧中添加地衣芽孢桿菌能明顯緩解這種變化趨勢，顯示出地衣芽孢桿菌的抗熱應(yīng)激作用。

熱應(yīng)激也可通過下丘腦-垂體-甲狀腺軸系統(tǒng)來影響甲狀腺的分泌功能，甲狀腺分泌的甲狀腺激素具有促進(jìn)機(jī)體代謝、增加機(jī)體產(chǎn)熱的作用，參與機(jī)體對冷熱的調(diào)節(jié)。熱應(yīng)激對畜禽影響的作用機(jī)制報(bào)道較為多見[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過高溫處理后的試驗(yàn)公兔，可使甲狀腺質(zhì)量下降，甲狀腺指數(shù)降低，與參考文獻(xiàn)[15] 中熱應(yīng)激可使甲狀腺萎縮結(jié)果相一致。甲狀腺的實(shí)質(zhì)主要由許多甲狀腺濾泡組成，而濾泡基膜由許多單層上皮組成，熱應(yīng)激使其單層上皮細(xì)胞胞核及旁細(xì)胞核溶解，胞膜輪廓邊界不清，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化明顯，因此改變了濾泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響甲狀腺激素T3、T4的合成和分泌，這是導(dǎo)致公兔生殖機(jī)能降低的原因。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌組可提高甲狀腺指數(shù)，緩解濾泡上皮細(xì)胞核溶解核胞質(zhì)發(fā)生空泡化的速度，保持濾泡上皮細(xì)胞的完整性。

3.2 地衣芽孢桿菌對甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞是產(chǎn)生甲狀腺素的重要場所。本試驗(yàn)電鏡觀察結(jié)果顯示，熱應(yīng)激時(shí)濾泡上皮細(xì)胞核萎縮嚴(yán)重，胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂明顯，線粒體減少，擴(kuò)張空泡化嚴(yán)重，斑馬體樣溶酶體增多，胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重，證明了熱應(yīng)激對甲狀腺的影響程度。熱應(yīng)激時(shí)細(xì)胞氧化磷酸化減少，使細(xì)胞缺少能量的供應(yīng)，蛋白質(zhì)合成受阻，從而影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，這一觀點(diǎn)從前期甲狀腺血漿T3、T4降低的測定結(jié)果也可得到驗(yàn)證[10，16-17]。而地衣芽孢桿菌組電鏡下甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞變化較熱應(yīng)激組小，溶酶體較多，有初級(jí)溶酶體出現(xiàn)，線粒體嵴擴(kuò)張輕微，高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較為發(fā)達(dá)，說明熱應(yīng)激下飼糧添加地衣芽孢桿菌對維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能的完整性起積極作用。甲狀旁腺中的嗜酸性細(xì)胞可能與疾病的發(fā)生有關(guān)，本試驗(yàn)中熱應(yīng)激組甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞電鏡觀察核固縮明顯，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，線粒體嵴斷裂，空泡化程度高，線粒體顆粒增多。而地衣芽孢桿菌組嗜酸性細(xì)胞變化較熱應(yīng)激組輕，細(xì)胞膜較為清晰，線粒體嵴出現(xiàn)輕微擴(kuò)張，有不發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在，說明地衣芽孢桿菌在飼糧中添加有利于提高機(jī)體抵抗力，恢復(fù)機(jī)體正常的生理功能 。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在熱應(yīng)激種公兔飼糧中添加1 000 mg/kg的地衣芽孢桿菌，可顯著降低熱應(yīng)激公兔血漿皮質(zhì)醇含量，緩解熱應(yīng)激對甲狀腺的損傷，對保持甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞形態(tài)和功能的完整性起決定作用，對熱應(yīng)激造成的甲狀旁腺嗜酸性細(xì)胞損傷也有緩解作用。