雞傳染性支氣管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達及其免疫原性

張 愉，袁 園，蘇艷靜，廖健淇，張 韜，張麗娟，范文勝，韋 平，磨美蘭

(廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530005)

雞傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性、呼吸道傳染的病毒性疾病，呈世界范圍流行。近年來,IB流行更加嚴重，給養(yǎng)殖戶帶來極大的經濟損失[1]。IBV基因組十分容易發(fā)生突變、缺失、插入及毒株間的同源重組，導致新基因型甚至新血清型不斷出現(xiàn)，且各血清型間交叉保護作用強弱不一[2-3]。IBV變異性極大以及具有地區(qū)流行特征，使得現(xiàn)有商品疫苗基本不能提供完全有效的保護[4]，且目前常用的疫苗在安全性和免疫原性方面存在缺陷[5-6]。因此，非常有必要研發(fā)與當?shù)豂BV優(yōu)勢血清型相吻合且高效安全的新型疫苗。

S蛋白是IBV最大的結構蛋白，在病毒入侵細胞時，S蛋白被宿主細胞蛋白酶裂解為S1和S2等2個亞型糖蛋白。S1蛋白主要產生血凝抑制抗體和誘導大部分病毒中和抗體[7-8]，是最重要的結構蛋白和保護性抗原，還決定了IBV毒株的血清型[1,9]；S2蛋白在大多數(shù)毒株中高度保守，主要激活病毒與宿主細胞融合，誘導中和抗體的抗原決定簇具有免疫優(yōu)勢[10-11]。因S蛋白相對分子質量太大難以表達，很少有關于全長S蛋白表達的報道。目前，國內外對IBV S基因的表達大多數(shù)都局限于對S1基因或截短的S或S1基因的研究[9,12]，尚未見其全長S蛋白表達的報道。

廣西家禽養(yǎng)殖量很大，IB近年來嚴重威脅廣西養(yǎng)殖業(yè)[13]。本試驗以IBV廣西地方流行毒株優(yōu)勢血清型代表株GX-YL5為對象，應用昆蟲桿狀病毒真核表達系統(tǒng)表達其S蛋白，制備了重組S蛋白的兔多抗血清，并驗證其反應原性和免疫原性，以期為研究IBV S蛋白的生物學功能、基因工程亞單位疫苗以及診斷試劑等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞、病毒及試驗動物pFastBacTM/HBM-TOPO轉座載體和DH10BacTM感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；Sf9昆蟲細胞、IBV GX-YL5毒株、對照毒株傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、馬立克病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)和禽偏肺病毒(aMPV)為廣西大學養(yǎng)禽與禽病學研究所保存；新西蘭大白兔購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑總RNA抽提試劑盒和DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；E.Z.N.A.?Endo-free Plasmid DNA Mini Kit購自OMEGA公司；BamHⅠ和HindⅢ購自TaKaRa公司；Sf-900TMⅡ SFM昆蟲細胞培養(yǎng)基購自GIBCO公司；SIM SF昆蟲培養(yǎng)基購自北京義翹神州科技有限公司；抗His標簽鼠源單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術有限公司；HRP標記的羊抗雞IgY購自Abbkine公司；FITC標記的羊抗兔IgG購自康為世紀生物公司；Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity和轉染試劑CellfectinⅡReagent購自Invitrogen公司。

1.3 引物的設計與目的基因的擴增根據(jù)GenBank中IBV GX-YL5毒株的序列(HQ848267.1)設計S基因對應的引物，上游引物P1：5′-AATTTGTTTCATTCTGGTAATTATGTG-3′；下游引物P2：5′-AGCAGACTTTTTAGGTCTGTATTG-3′。后期用于重組桿粒PCR鑒定及轉染后PCR鑒定的M13載體通用引物，上游引物P3：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′；下游引物P4：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。引物交由北京華大基因公司合成。將本課題組前期構建的pEasy-HBM-S重組質粒保存菌重新增殖后，進行質粒抽提，利用Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity擴增S基因片段。

1.4 重組轉座載體的構建與鑒定將獲得的S基因片段的純化產物與pFastBacTM/HBM-TOPO利用拓撲反應進行平末端連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過菌液PCR、酶切鑒定及測序對其進行鑒定。將鑒定完全正確的陽性單克隆菌液進行質粒抽提，獲得重組轉座載體pFastBacTM/HBM-TOPO-S。

1.5 重組桿狀病毒的獲取與純化抽提S基因重組轉座載體保存菌的質粒后，轉化MAX Efficiency?DH10BacTMCompetentE.coliCells，經Gen、Kan、Tet 3種抗生素及IPTG、X-gal進行藍白斑篩選，挑取白色單克隆并用M13引物進行菌落PCR鑒定。當擴增產物同時出現(xiàn)目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)和300 bp的條帶時，再重新劃板篩選，繼續(xù)挑取純白菌落，直至擴增產物只出現(xiàn)目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)，則純化完成。抽提轉化菌質粒獲得純化的重組桿粒，通過脂質體介導轉染Sf9細胞以獲得重組桿狀病毒rHBM-S。

1.6 重組蛋白的鑒定

1.6.1IFA鑒定 經PCR鑒定完全正確的重組桿狀病毒繼續(xù)在Sf9細胞中進行增殖培養(yǎng)至第4代，接種處于對數(shù)生長期的Sf9細胞(同時設空載體對照和細胞對照)，培養(yǎng)72 h待細胞出現(xiàn)病變后，進行IFA鑒定。以鼠抗His標簽的單克隆抗體(1∶500稀釋)為一抗，以FITC標記的羊抗鼠IgG抗體(1∶300稀釋)為二抗，倒置熒光顯微鏡觀察記錄結果。

1.6.2Western blot鑒定 將P4代重組桿狀病毒接種于Sf9細胞中(同時設空載體對照和細胞對照)，培養(yǎng)72 h，分別收集培養(yǎng)上清和細胞沉淀，進行Western blot分析。分別以鼠抗His標簽單克隆抗體和本課題組制備保存的抗GX-YL5毒株的雞多抗血清(1∶2 000稀釋)為一抗，以HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗雞IgY(1∶5 000稀釋)為二抗，ECL顯色觀察蛋白的表達。

1.7 重組S蛋白的純化和多抗血清的制備按照前期摸索的重組S蛋白表達的最佳條件大量表達后，采用Ni-NTA樹脂進行重組蛋白的純化，純化步驟按說明書進行，收集洗脫液進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色鑒定。純化的重組S蛋白經超濾管濃縮后，測定其蛋白質量濃度，并調整蛋白質量濃度至500 mg/L，免疫健康成年新西蘭大白兔，共免疫4次，每次免疫間隔時間為10 d。首免使用1 mg重組S蛋白與弗氏完全佐劑等比例乳化混勻，加強免疫使用500 μg重組S蛋白與等量弗氏不完全佐劑等比例混勻，第4次免疫后10 d進行心臟采血并分離血清。首免前采血作為陰性血清對照。

1.8 多抗血清的特性驗證

1.8.1IFA驗證 對數(shù)生長期Sf9昆蟲細胞感染重組桿狀病毒rHBM-S后72 h進行IFA鑒定。一抗使用制備的兔抗S蛋白多抗血清(1∶200稀釋)，二抗使用FITC標記的羊抗兔IgG(1∶300稀釋)，同時設細胞對照。

1.8.2Western blot驗證 對數(shù)生長期Sf9細胞感染重組桿狀病毒rHBM-S，72 h細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變時收集表達產物進行Western blot鑒定。用制備的兔抗S蛋白多抗血清(1∶4 000稀釋)作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗進行檢測，同時設陰性血清對照。

1.8.3間接ELISA測定抗體效價 用純化重組S蛋白作為包被抗原，包被質量濃度為10 mg/L，包被后用5%脫脂奶粉封閉液于37℃濕盒中封閉2 h，采用間接ELISA方法檢測重組S蛋白兔多抗血清抗體效價。將多抗血清作為一抗，用PBST稀釋成1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600，1∶51 200共11個稀釋度；首免前的陰性血清作為陰性對照，同等稀釋度稀釋；用HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)作為二抗；Bio-Rad酶標儀測定各孔在450 nm波長下的D值。若兔多抗血清不同稀釋度的D值/同等稀釋度陰性血清的D值>2.1，則判定為陽性，反之，則判定為陰性。以最高抗體稀釋度為陽性的血清稀釋度的倍數(shù)作為該血清的抗體效價。

1.8.4多抗血清的特異性鑒定 采用間接ELISA方法，分別以IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV病毒液、陰性尿囊液和純化的重組S蛋白作為抗原，多抗血清(1∶25 600稀釋)作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)作為二抗，酶標儀讀取450 nm波長下的D值。

1.8.5中和試驗 參照本課題組方法[14]取18～20日齡健康雞胚的氣管制備氣管環(huán)。參照Reed-Muench法計算GX-YL5株的雞胚氣管環(huán)半數(shù)感染量(TOC-ID50)和采用稀釋多抗血清固定病毒的方法進行TOC中和試驗[3]。設立GX-YL5毒株多抗血清陽性對照和陰性血清對照。

2 結果

2.1 S基因的擴增及重組轉座載體的鑒定經RT-PCR得到大小為3 453 bp的S基因，與目的片段預期大小相符。重組轉座載體pFastBacTM/HBM-TOPO-S的 PCR鑒定表明獲得約為3 453 bp的S基因條帶，BamHⅠ單酶切得到與預期大小相符的8 277 bp片段，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到與預期大小相符的4 670 bp和3 607 bp的2個片段(圖1)。測序結果正確，表明成功構建了S基因的重組轉座載體。

2.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定將重組轉座質粒pFastBacTM/HBM-TOPO-S轉化DH10Bac細胞，經初步篩選后菌落PCR鑒定可見300 bp和5 953 bp 的2條片段，重新劃線純化篩選后，菌落PCR鑒定只含有5 953 bp的條帶，條帶大小均符合預期(圖2)，表明純化的重組桿粒構建成功。

將重組桿粒轉染Sf9細胞得到的重組桿狀病毒用S基因特異性引物及M13通用引物進行PCR鑒定。結果顯示，S基因特異性引物PCR擴增出3 453 bp 的條帶，M13載體通用引物PCR擴增出6 043 bp(3 453 bp+2 500 bp)的條帶，且空桿粒擴增產物為300 bp，未感染細胞M13引物PCR鑒定沒有條帶(圖3)，表明獲得純化的重組桿狀病毒rHBM-S。

M.1 kb DNA Ladder；1.pFastBacTM/HBM-TOPO-S雙酶切鑒定；2.pFastBacTM/HBM-TOPO-S單酶切鑒定；3.S基因特異性引物菌液PCR鑒定

M1.1 kb DNA Ladder；M2.Trans 2kTM 2000 DNA Marker；1.純化的rHBM-S PCR產物；2.未純化的rHBM-S PCR產物；3.空桿粒PCR產物

2.3 重組S蛋白的IFA鑒定將鑒定正確的重組桿狀病毒接種處于對數(shù)生長期的Sf9細胞，培養(yǎng)72 h待細胞出現(xiàn)病變后，進行IFA鑒定。IFA檢測結果顯示，感染rHBM-S的細胞胞漿中出現(xiàn)了極強的綠色特異性熒光，空載體對照組和細胞對照組無特異性熒光(圖4)，表明重組S蛋白已獲得表達。

A.感染rHBM-S的細胞；B.空載體對照；C.細胞對照

2.4 重組S蛋白的Western blot鑒定Western blot鑒定結果顯示，重組S蛋白可與抗His標簽鼠源單克隆抗體(圖5A)及抗GX-YL5毒株的多抗血清(圖5B)反應，在感染細胞沉淀均出現(xiàn)與天然蛋白大小一致的190 kDa特異性蛋白帶。

M.蛋白質相對分子質量標準(10～180 kDa);1.感染細胞培養(yǎng)上清;2.感染細胞沉淀;3.空載體對照;4.細胞對照。A.重組S蛋白與抗His標簽鼠源單克隆抗反應；B.重組S蛋白與抗GX-YL5毒株的多抗血清反應

2.5 多抗血清的特性驗證

2.5.1多抗血清的IFA鑒定 IFA檢測結果表明，制備的多抗血清能夠與表達的重組S蛋白結合，感染的細胞表面呈現(xiàn)較強的特異性熒光，而細胞對照未檢測到特異性熒光信號(圖6)，說明制備的抗S蛋白多抗血清具有良好的特異性。

A.感染rHBM-S的Sf9細胞；B.細胞對照

2.5.2多抗血清的Western blot鑒定 Western blot鑒定結果顯示，制備的多抗血清與感染重組桿狀病毒rHBM-S的表達產物反應，出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的190 kDa特異性蛋白帶，而陰性血清未出現(xiàn)相應目的條帶(圖7)，說明制備的血清特異性較好，且能夠用于Western blot驗證。

M.蛋白質相對分子質量標準(10～180 kDa)；1.S蛋白多抗血清；2.S蛋白陰性血清

2.5.3多抗血清抗體的間接ELISA效價測定結果 將純化后的重組S蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA檢測多抗血清的抗體效價。比較多抗血清不同稀釋度下D450值及P/N值，確定制備的S蛋白多抗血清的抗體效價為1∶25 600(表1)。

表1 S蛋白血清抗體效價檢測結果 D450值

2.5.4多抗血清的特異性鑒定結果 間接ELISA檢測結果表明，該多抗血清對重組S蛋白有很強的特異性，與參考毒株IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV沒有交叉反應(表2)。

表2 多抗血清特異性鑒定

2.5.5多抗血清的中和滴度檢測結果 根據(jù)Reed-Muench法測得GX-YL5毒株TOC-ID50為10-6.46/0.2 mL。氣管環(huán)中和試驗結果顯示，S蛋白多抗血清中和滴度為1∶512，GX-YL5多抗血清陽性對照的中和滴度為1∶512，且陰性血清對照無中和作用，表明制備的兔抗S蛋白多抗血清對IBV具有明顯的中和作用，重組S蛋白具有良好的免疫原性。

3 討論

S基因是IBV最主要的抗原基因，其編碼的S蛋白是IBV最大的結構蛋白[15]。S蛋白具有許多重要的生物學功能，包括含有與病毒中和、血凝抑制抗體、細胞吸附、組織親和性、毒力、血清型特異性有關的抗原位點[16-17]，也是IBV蛋白中變異程度最大的結構蛋白[18]，因此表達S蛋白作為診斷試劑或研發(fā)基因工程亞單位疫苗都是比較理想的。

不同的外源蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達量有所差異，獲得最大的蛋白表達量是研發(fā)重組亞單位疫苗和大量表達蛋白制備多克隆抗體的前提和基礎。因IBV S蛋白相對分子質量太大難以表達，大多研究都是基于S1蛋白或截短的S蛋白的表達。沈行燕[19]利用原核細胞表達了IBV-ZJ971毒株的 S蛋白，但大小只有118 kDa，且表達量不高。唐應華等[20]運用昆蟲桿狀病毒對IBV DS10株的S基因進行了表達，但只是在研究中利用IFA試驗鑒定了其重組蛋白的反應原性，未對其相對分子質量進行考究。LIU等[21]的報道，他們應運用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達出了IBV H120株的S蛋白，蛋白大小為170 kDa，與IBV S蛋白的天然大小(170～200 kDa)較接近，但是表達的毒株不是地方流行株。目前，關于在原核表達系統(tǒng)中制備IBV M和E蛋白多克隆抗體的研究已有報道[22-23]，但還沒有在真核表達系統(tǒng)表達IBV全長S蛋白并進行多克隆抗體制備的相關研究。

本試驗對GX-YL5株S蛋白的全長相對分子質量進行估算，其相對分子質量應約為128 kDa，采用了具有昆蟲細胞能識別和剪切的HBM信號肽的pFastBacTM/HBM-TOPO桿狀病毒表達系統(tǒng)進行表達，經過反復試驗成功在真核表達系統(tǒng)中獲得了相對分子質量約為190 kDa的全長S蛋白，與天然S蛋白相對分子質量大小相符，說明表達的S蛋白在真核系統(tǒng)中得到了較為完備的修飾。經過進一步純化進而免疫新西蘭大白兔，制備的多抗血清在IFA、Western blot和特異性驗證試驗中都呈現(xiàn)較好的特異性。此外，該多抗血清的ELISA抗體效價高達1∶25 600，中和試驗滴度為1∶512，與GX-YL5全病毒多抗血清相同，說明S蛋白多抗血清對IBV具有明顯的中和作用。本課題組目前分別表達了IBV廣西優(yōu)勢血清型代表株GX-YL5的S蛋白、S1蛋白、M蛋白和E蛋白，下一步考慮共感染制備病毒樣顆粒疫苗，并對其免疫原性和免疫保護作用及初步臨床應用進行研究。

本試驗利用昆蟲桿狀病毒真核表達系統(tǒng)成功表達了IBV全長S蛋白并制備了多抗血清，且具有良好的反應原性和免疫原性，為進一步研究IBV S蛋白的生物學功能、研發(fā)診斷試劑、制備基因工程亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎，也為利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)進行其他冠狀病毒結構蛋白的表達及多抗的制備提供了借鑒和參考。