人參莖葉總皂苷聯(lián)合亞硒酸鈉對豬偽狂犬病滅活疫苗免疫的增強作用

MAQBOOL Babar，王 勇，崔雪梅，袁麗佳，胡松華

(浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度接觸性動物傳染病，主要感染豬、牛、羊、犬、貓、兔等動物[1]。豬是PRV的唯一自然宿主，15日齡以內仔豬感染PRV后的病死率可達100%，斷奶仔豬感染發(fā)病后的病死率為10%～20%，此病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。長期以來，預防此病的方法主要通過給豬接種gE基因缺失弱毒疫苗。然而，近些年一些豬場免疫了弱毒疫苗后出現(xiàn)PRV變異株流行暴發(fā)情況[3]。與弱毒疫苗比較，滅活疫苗具有更好的安全性。但滅活疫苗主要誘導動物產(chǎn)生體液免疫，而對細胞免疫作用不大[4]。動物在抵御PRV感染過程中，主要是細胞免疫發(fā)揮保護作用。因此，研究提高疫苗免疫效果的方法，增強動物的抗病能力具有重要的臨床意義。

研究表明，從中藥人參(PanaxginsengC.A.Meyer)莖和葉中提取的人參莖葉總皂苷(GSLS)對許多動物疫苗的免疫具有增強作用。馬艷粉等[5-6]報道，口服GSLS能夠顯著性提高口蹄疫(FMD)疫苗免疫小鼠的特異性IgG及其亞類水平。據(jù)報道，飲水口服GSLS對雞免疫新城疫(ND)滅活疫苗和禽流感(AI)滅活疫苗均有免疫增強作用[7-8]。硒是一種人和動物必需的微量元素，具有增強機體免疫力的作用，以亞硒酸鈉(Na2SeO3，簡稱Se)的形式在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛[9-10]。本試驗擬研究動物口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se對 PRV滅活疫苗免疫的增強作用，為臨床上如何采用中藥提高滅活疫苗的免疫效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性ICR小鼠(18～22 g)，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養(yǎng)于實驗室IVC獨立送風飼養(yǎng)籠具，自由采食與飲水，室內溫度為(25±1)℃，濕度為(50±10)%，飼養(yǎng)1周后開始試驗。

1.2 細胞、病毒和疫苗豬腎傳代細胞系PK-15由浙江大學動物科學學院中獸醫(yī)實驗室保存；偽狂犬病病毒野毒株(fPRV)，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院惠贈，分離自PR病死豬，用于PK-15細胞擴增和TCID50檢測；豬PR滅活疫苗，購自武漢科前生物股份有限公司(批號：180416)。

1.3 主要試劑和藥品豬PRV gB抗體檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；人參莖葉總皂苷(GSLS)，購自吉林宏久生物科技股份有限公司；亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se)購自上海今品化學技術有限公司；刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和MTT，購自Sigma公司；胰酶消化液(0.25% 胰酶+0.02% EDTA)，購自杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司；HRP標記標記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a抗體，購自Santa Cruz公司；紅細胞裂解液，購自北京索萊寶生物科技有限公司；Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 ELISA檢測試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。

1.4 主要耗材與儀器MCO-15AC CO2細胞培養(yǎng)箱，購自日本SANYO公司；Multiskan MK3酶標儀，購自美國Thermo公司；XDS-1B 倒置顯微鏡，購自重慶光電儀器有限公司；5810R離心機，購自德國Eppendorf公司。

1.5 疫苗免疫劑量的篩選ICR小鼠隨機分成4組，每組6只，分別肌肉注射免疫0.1 mL用生理鹽水稀釋10，50，100倍和未稀釋的PRV滅活疫苗，免疫后2周采血，檢測血清特異性PRV gB抗體水平，篩選出合適的疫苗免疫劑量。

1.6 動物分組與處理ICR小鼠隨機分成5組，每組6只。第1組為空白組(non-immune)，不免疫；第2組,PRV滅活疫苗對照組(PRV)；第3組,免疫前灌胃GSLS(0.5 mg/d)，連續(xù)給藥4 d，然后注射PRV滅活疫苗(GSLS/Pre+PRV)；第4組，在PRV滅活疫苗添加30 mg/L的Se(Se+PRV)；第5組，免疫前灌胃GSLS(0.5 mg GSLS)，連續(xù)給藥 4 d，然后注射添加Se(30 mg/L)的PRV滅活疫苗(GSLS-Se+PRV)。小鼠肌肉注射疫苗2次，每次注射疫苗0.1 mL，間隔2周。加強免疫后2,3,4周采血，制備血清，最后一次采血后處死小鼠并分離脾淋巴細胞。用ELISA方法檢測血清gB抗體及亞類水平，脾淋巴細胞用于檢測淋巴細胞增殖水平及細胞因子水平。

1.7 血清特異性PRV gB抗體及其亞類檢測根據(jù)PRV gB抗體檢測試劑盒說明，用阻斷ELISA法檢測血清中特異性PRV gB抗體水平?？贵w阻斷率=[1-S(樣品D值)/N(陰性對照D值)]×100%。使用同樣的ELISA檢測試劑盒，向試劑盒包被板每孔加入100 μL待檢測血清(1∶2稀釋)，置于18～26℃ 孵育60 min后用洗滌液洗板3～5次;將板拍干，隨后每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG1或IgG2a抗體，置于37℃孵育60 min后用洗滌液洗板3～5次;將板拍干后每孔加入100 μL TMB底物溶液，置于18～26℃ 孵育，15 min后每孔加入50 μL終止液，于D450 nm讀數(shù)。

1.8 淋巴細胞增殖試驗將小鼠斷頸處死，用75%酒精浸泡5～10 min，無菌操作取脾臟，加入5 mL完全Hank's液，用研缽研磨后過200目銅網(wǎng)，濾液離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清。加入3 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞，靜止3 min后離心，棄上清。使用完全Hank's液清洗細胞并計數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度至5×106/mL。將細胞加入至96孔板中(100 μL/孔)，后加入100 μL ConA(終質量濃度5 mg/L)、LPS(終質量濃度5 mg/L)或PRV抗原(經(jīng)56℃、30 min處理后的fPRV野毒，5×105TCID50)，輕輕混勻后，培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束前4 h加入20 μL MTT(5 g/L)。離心培養(yǎng)板(1 800 r/min，10 min)并小心倒去細胞培養(yǎng)液，再向每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩溶解結晶后置于酶標儀上測量D570 nm。刺激指數(shù)(SI)的計算公式如下：SI=(D刺激孔-D空白孔)/(D未刺激孔-D空白孔)。

1.9 細胞因子檢測按1.8中方法收集脾細胞，調整細胞濃度至5×106/mL，使用PRV抗原(經(jīng)56℃ 30 min處理后的fPRV野毒，5×105TCID50)刺激，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測Th1(IFN-γ，IL-2)和Th2(IL-4，IL-6)型細胞因子的分泌水平。

1.10 攻毒保護試驗小鼠加強免疫后2周，腹腔注射致死劑量的fPRV(5×105TCID50)，連續(xù)觀察10 d，并記錄小鼠癥狀和死亡情況。

2 結果

2.1 疫苗免疫劑量篩選給小鼠分別免疫未稀釋和用生理鹽水稀釋10，50，100倍后的PRV滅活疫苗，檢測免疫后2周小鼠血清gB抗體水平。由圖1可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，疫苗誘導小鼠產(chǎn)生的gB 抗體水平也逐漸降低。為更好觀察GSLS-Se對PRV滅活疫苗的佐劑效果，最終選擇100倍作為后續(xù)試驗疫苗的稀釋倍數(shù)。

2.2 GSLS-Se對小鼠血清特異性PRV gB抗體水平的影響由圖2可知，與PRV疫苗對照組相比，免疫前口服GSLS或者在疫苗中添加Se可顯著提高抗體水平，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se可產(chǎn)生更高的抗體水平。

圖1 不同稀釋倍數(shù)對PRV滅活疫苗誘導的小鼠gB抗體水平的影響

*.示P<0.05;**.示P<0.01;***.示P<0.001。下同

2.3 GSLS-Se對小鼠血清特異性PRV gB抗體亞類水平的影響與PRV疫苗對照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se顯著提高了小鼠血清中特異性PRV gB抗體的IgG1和IgG2a水平(圖3)。

2.4 GSLS-Se對小鼠脾淋巴細胞增殖及產(chǎn)生細胞因子的影響與PRV疫苗對照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se顯著提高了小鼠脾淋巴細胞在體外受ConA、LPS和PrV抗原刺激后的增殖能力(圖4)，并顯著上調了淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子(INF-γ、IL-2和IL-6)水平(圖5)。

2.5 小鼠攻毒保護試驗用強毒(fPRV)腹腔注射小鼠，空白組小鼠和口服GSLS組小鼠在攻毒后36 h 均出現(xiàn)啃咬后背，后肢抽搐和共濟失調等神經(jīng)癥狀，并從48 h開始死亡，60 h時2個組小鼠全部死亡。PRV疫苗組小鼠在攻毒后48 h出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，從60 h開始死亡，最終小鼠存活率為50%(5/10)，而GSLS-Se+ PRV疫苗組的小鼠的存活率為70%(7/10)(圖6)。

圖3 小鼠血清特異性PRV gB抗體亞類IgG1 (A)和IgG2a (B)水平

圖4 小鼠脾淋巴細胞增殖水平

3 討論

本試驗結果表明，與PRV疫苗對照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在PRV滅活疫苗中添加Se能夠促進小鼠產(chǎn)生更高的特異性PRV gB抗體水平，增強動物的體液免疫應答。體液免疫在動物抗PRV的過程中發(fā)揮著重要的作用。PRV表面的gB糖蛋白是一種主要的保護性抗原，抗PRV gB抗體可以阻斷病毒入侵細胞[11-12]。當病毒入侵細胞之后，細胞的免疫應答發(fā)揮重要的抗病毒作用。淋巴細胞增殖水平反映了機體細胞免疫應答水平。不同的絲裂原刺激不同的淋巴細胞發(fā)生增殖和分化，Con A刺激T淋巴細胞，而LPS刺激B淋巴細胞[13]。本試驗結果表明，GSLS-Se能夠顯著提高ConA、LPS和PRV抗原誘導的淋巴細胞增殖水平，說明細胞免疫水平提高了。在細胞免疫應答過程中，激活的T細胞分泌多種具有免疫調節(jié)作用的細胞因子，Th1型細胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等細胞因子，Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子。機體抗體亞類的產(chǎn)生受不同細胞因子的影響，Th1型細胞因子促進B淋巴細胞產(chǎn)生具有抗病毒作用的IgG2a，而Th2主要促進機體產(chǎn)生IgG1[14-17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，GSLS-Se能夠顯著性提高小鼠血清IgG2a和IgG1亞類水平，并顯著上調免疫小鼠脾淋巴細胞經(jīng)PRV抗原刺激后Th1型(IFN-γ，IL-2)和Th2型(IL-6)細胞因子的分泌水平，說明GSLS-Se對Th1型和Th2型免疫應答均有促進作用。

圖5 小鼠脾淋巴細胞細胞因子IFN-γ(A)、IL-2 (B)、IL-4 (C)和IL-6 (D)水平

圖6 小鼠攻毒后的生存率

口服是中藥的傳統(tǒng)給藥途徑。YU等[8]證明口服GSLS能夠顯著提高免疫抑制狀態(tài)下的雞對滅活雞新城疫和流感二聯(lián)疫苗的免疫應答水平。LI等[6]報道，免疫前口服GSLS能夠顯著性提高小鼠特異性FMD IgG及其亞類水平。Se是人和動物必需的微量元素，有研究報道在豬瘟疫苗中添加Se使動物血液中B淋巴細胞數(shù)量增多，并能夠快速誘導動物產(chǎn)生特異性抗體，且維持較長時間[18]。毛跟年等[19]報道，在AI滅活疫苗中添加Se能顯著提高雞HI抗體水平。在本研究中，口服GSLS配合在疫苗中添加Se可顯著增強PRV滅活疫苗誘導的體液免疫和細胞免疫應答水平，提高免疫動物抵抗PRV野毒感染的能力。因此，GSLS-Se的免疫增強作用是由于GSLS和Se共同起作用的結果，值得在本動物上進行進一步的研究。