河北省豬場偽狂犬病病毒感染情況調(diào)查及gE基因遺傳變異分析

左玉柱，王丙雷，韓 磊，王 晶，袁廣富，張建樓，范京惠*，仲 飛1，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)又稱奧耶斯基病，該病的病原為偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)，是一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的病毒性傳染病。PRV屬于豬皰疹病毒Ⅰ型[1-2]。PRV宿主范圍較廣，可感染反芻動(dòng)物、肉食動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和豬等多種哺乳動(dòng)物，其中豬為PRV的自然宿主，也是唯一的貯存宿主[3-5]。PRV感染豬后，引起母豬繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、不育等；新生仔豬則主要引起腦脊髓炎，表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀和呼吸困難，死亡率高；育肥豬和成年豬對(duì)PRV 有一定的抵抗力，死亡率低，但耐過豬易感染其他疾病，且長期攜帶毒并排毒，成為新的傳染源[2-3,6-8]。由PRV引起的豬偽狂犬病，在我國以及養(yǎng)豬密度較大的一些國家和地區(qū)廣泛傳播，給發(fā)病豬場造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2,5,7,9]。

疫苗免疫在偽狂犬病的防制過程中起到了至關(guān)重要的作用。基因缺失活疫苗(如gE缺失疫苗等)在豬場的廣泛應(yīng)用，有效降低了該病的發(fā)病率和死亡率，減少了豬場的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。然而，自2011年中國出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的PRV變異株以來，偽狂犬病在疫苗免疫豬場的不斷暴發(fā)，一些PRV陽性豬場的持續(xù)感染，以及一些豬場由PRV 陰性轉(zhuǎn)為PRV陽性的現(xiàn)狀，又給我國PRV防控帶來了新的挑戰(zhàn)，也使偽狂犬病被列為《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020 年)》中優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一[10]。實(shí)現(xiàn)對(duì)PRV 的有效防制和根除，掌握PRV在豬群中感染情況的詳盡數(shù)據(jù)是必不可少的環(huán)節(jié)。然而，目前有關(guān)河北省PRV 流行病學(xué)方面的信息卻十分有限，為了了解PRV野毒毒株在河北省豬場的感染情況，本試驗(yàn)對(duì)河北省豬場開展了血清學(xué)和病原學(xué)的調(diào)查，并對(duì)流行毒株的gE基因進(jìn)行了分析，以探明河北省豬場PRV感染程度和gE基因變異狀況，為河北省PRV的防制提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清和病料血清來自河北省不同地區(qū)、不同規(guī)模豬場中不同生長階段的豬，病料來源于流產(chǎn)胎兒的腦、脾臟和淋巴結(jié)。

1.2 主要試劑與儀器PRV-gE抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司；PRVV gE基因PCR檢測試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨有限公司；DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；PK-15由本實(shí)驗(yàn)室保存；Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、10%胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Heal Force Neofuge 13R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Thermo 酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司產(chǎn)品；單通道移液器及多通道移液器(5～50 μL)購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上登錄的序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性擴(kuò)增PRV gE基因的引物(表1)。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.4 血樣采集和處理豬血清來源于河北省不同地區(qū)、不同規(guī)模的豬場，按照妊娠母豬、哺乳母豬、空懷母豬、后備母豬、公豬、仔豬(2，3，4，7周齡)和育肥豬(11，17 周齡)等分階段采血；根據(jù)豬場母豬存欄數(shù)不同，將豬場分為50頭母豬以下、50～300 頭、300～800 頭、800 頭等4類(存欄頭數(shù)均含下限不包括上限),50頭母豬以下者每組采集血樣4份，50～300頭母豬的豬場，每組采集5份，300～800頭母豬的豬場，每組采集血樣6份，800頭母豬以上者，每組采集8份。選擇豬場過程中，如個(gè)別豬場個(gè)別階段豬數(shù)量不夠采樣要求，按實(shí)際數(shù)量進(jìn)行。每份血樣采集3～4 mL，離心后取血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PRV gE抗體的檢測操作方法嚴(yán)格按照美國IDEXX公司的PRV-gE抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行。所有加樣和洗板過程均在室溫進(jìn)行，加樣后的ELISA板置于恒溫箱22.5℃反應(yīng)。所有反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀測定各孔的D650 nm值。通過計(jì)算樣品與陰性對(duì)照的比值(S/N)，判斷樣品中PRV野毒株抗體陰陽性。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)S/N≤0.6時(shí),樣品確定為陽性；S/N>0.7，樣品確定為陰性；0.6

1.6 流產(chǎn)胎兒中PRV的檢測從河北省發(fā)生流產(chǎn)的豬場采集病料，主要收集流產(chǎn)的胎兒。將流產(chǎn)胎兒的腦、脾臟和淋巴結(jié)混合后研磨，離心取上清，使用PCR gE檢測試劑盒(anheal，中國北京)檢測，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 部分豬場PRV gE基因的擴(kuò)增取PRV PCR檢測結(jié)果為陽性的材料，按照DNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行基因組DNA的提取，并以提取的DNA作為模板，使用引物gEP1和gEP2，通過PCR擴(kuò)增PRV的gE全基因。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×GC Buffer 10 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 3 μL，20 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，DNA模板 3.5 μL，rTaq酶 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物， 1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 序列測序gE基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，并使用膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司(Sangon Biotech，中國上海)進(jìn)行序列測定。

1.9 基因遺傳進(jìn)化分析從GenBank內(nèi)查找PRV gE基因核苷酸序列，篩選部分序列作為參考毒株序列，使用MEGA 7.0軟件中的Crustal W程序?qū)y序序列和參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，并使用MEGA 7.0軟件通過近Neighbor-Joining方法構(gòu)建10 000個(gè)自舉復(fù)制的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 血清樣品收集情況2018年1月至2019年5月共17個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，從195個(gè)豬場采集血樣，其中2018年130個(gè)豬場，2019年1-5月豬場65個(gè)。存欄50頭母豬以下的豬場90個(gè)，50～300 頭母豬的豬場60個(gè)，存欄300～800 頭母豬的豬場30個(gè)，存欄800頭母豬以上的豬場15個(gè)，每組按照預(yù)定方案采取樣品，部分規(guī)模小的豬場空懷母豬和公豬少于預(yù)計(jì)數(shù)量，按實(shí)際采血份數(shù)計(jì)算。有效血樣共計(jì)10 479 份，血樣具體分布見表2。

表2 血樣采集信息 頭

2.2 gE抗體檢測結(jié)果

2.2.1不同階段豬血清gE抗體陽性率 在收集的10 479份血清樣品中，gE抗體陽性5 245份(其中含 42 份可疑血清，為方便統(tǒng)計(jì)，將可疑血樣歸入陽性樣品統(tǒng)計(jì))，樣本總的陽性率為50.05%。按照豬不同階段進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖1。種豬群中陽性率最高的是空懷母豬，為73.75%%；陽性率最低的是公豬群，為33.01%。在仔豬、保育和育肥豬群，2周齡仔豬陽性率最高，為57.50%；7周齡豬抗體陽性率最低，為22.92%；但是7周齡之后，11周齡和17周齡豬的抗體陽性率呈上升趨勢(shì)，17周齡時(shí)抗體陽性率為55.73%。2018年與2019年血清gE抗體陽性率相比，2019年1-5月各階段血清gE抗體陽性率比2018年均有明顯降低。

2.2.2不同規(guī)模豬場gE抗體陽性率 對(duì)檢測結(jié)果按照不同規(guī)模的豬場進(jìn)行血清陽性率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，隨著規(guī)?；潭鹊脑黾樱琯E抗體陽性比例整體呈下降趨勢(shì)。但存欄50～300頭母豬的豬場野毒抗體陽性率最高，為57.60%；存欄800頭母豬以上的豬場，血清gE抗體陽性率最低，為35.68%(圖2)。

2.2.3不同規(guī)模豬場場群陽性率 對(duì)場群陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示195個(gè)豬場中，存在陽性血樣的豬場161個(gè)，豬場總陽性率為82.56%；其中，50～300頭母豬的60個(gè)豬場中，53個(gè)豬場存在陽性血樣，陽性率最高，達(dá)88.33%；15個(gè)超過800頭母豬的規(guī)?；i場中也有10個(gè)豬場存在陽性血清，陽性率為66.67%(圖3)。

2.2.4不同地區(qū)豬場血清gE抗體陽性率 對(duì)河北省不同地區(qū)陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示邢臺(tái)市豬場血清gE抗體陽性率最高，為58.26%；張家口豬場和承德市豬場gE抗體陽性率較低，分別為34.37%和42.57%(圖4)。

2.3 流產(chǎn)胎兒中PRV gE基因的檢測2018-2019年從河北省76個(gè)發(fā)生流產(chǎn)的豬場共收集到流產(chǎn)胎兒204個(gè)，使用PRV gE基因PCR檢測試劑盒對(duì)其進(jìn)行PRV檢測，結(jié)果顯示54個(gè)胎兒gE基因檢測結(jié)果為陽性，整體陽性率26.47%；按照不同規(guī)模的豬場進(jìn)行陽性率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50～300 頭規(guī)模豬場的流產(chǎn)胎兒PRV陽性率最高，為31.43%；800頭以上的豬場陽性率最低，為22.73%(圖5)。

2.4 gE全基因擴(kuò)增和序列測定從PCR檢測PRV gE基因呈陽性的病料中選擇部分材料，進(jìn)行g(shù)E全基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，在1 900 bp處出現(xiàn)目的條帶，與gE基因擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小相符者為陽性。使用凝膠回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，共獲得gE全基因陽性產(chǎn)物9份，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定，由于gE基因GC含量高，有1份重復(fù)測序3次未成功，共獲得gE全基因序列8份。

圖1 不同階段豬血清中g(shù)E抗體陽性率

圖2 不同規(guī)模豬場之間豬血清中g(shù)E抗體陽性率比較

圖3 不同規(guī)模豬場場群陽性率比較

圖4 河北省不同地區(qū)豬場豬血清中g(shù)E抗體陽性率

2.5 gE基因遺傳進(jìn)化分析本試驗(yàn)中獲得的8個(gè)gE全基因序列之間，核苷酸同源性為99.8%～100.0%，與國內(nèi)外其他參考毒株的核苷酸同源性為97.5%～100.0%。核苷酸進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖6)，包括本試驗(yàn)獲得的8個(gè)gE基因在內(nèi)的47個(gè)PRV gE基因序列被分為2個(gè)基因型，歐美毒株屬于基因Ⅰ型，中國毒株屬于Ⅱ型，國內(nèi)的毒株整體上又分為2個(gè)亞群，其中2011年之前的毒株大部分屬于SⅠ亞群，2011年之后的大部分屬于SⅡ亞群，這與2011年以后，中國出現(xiàn)PRV的變異株，且變異株在中國豬場不斷暴發(fā)的現(xiàn)狀想吻合，本試驗(yàn)中所獲得的8株P(guān)RV均屬于SⅡ亞群。

▲.本次試驗(yàn)所得到的序列；●.本實(shí)驗(yàn)室2012年獲得的序列

3 討論

偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，給感染豬場造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。在偽狂犬的防控過程中，我國普遍使用的是PRV基因缺失疫苗。盡管目前所使用的基因缺失疫苗有多種，但基本都缺失了gE基因，因此免疫了PRV基因缺失疫苗的豬場，如果不存在PRV野毒感染，PRV gE抗體應(yīng)該為陰性。當(dāng)感染PRV野毒時(shí)，gE抗體則為陽性。對(duì)gE抗體進(jìn)行檢測，可用于區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。歐洲和北美一些國家已經(jīng)通過gE基因缺失疫苗的強(qiáng)制免疫、以及與之相匹配的野毒毒株gE基因/抗體檢測，掌握PRV在豬群中的感染情況，淘汰陽性豬等方式，實(shí)現(xiàn)了PRV 的凈化[2,3,10]。這為我國PRV的防控和凈化措施提供了參考。

近幾年，國內(nèi)不同省份和地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，gE抗體個(gè)體陽性率在全國的數(shù)量逐漸下降，但場群陽性率仍然很高[11-16]。李桂霞等[17]對(duì)2018 年11月1日至11月20日，從河北省8個(gè)地區(qū)不同中小型規(guī)模豬場采集的481份母豬血液進(jìn)行PR-gE 抗體的檢測，結(jié)果顯示樣本總陽性率為40.96%(197/481)，且不同地區(qū)的差異很大。但該研究所檢測樣本所涵蓋的時(shí)間段較短(僅 20 d)，且采集的樣本數(shù)較少，因此，尚不能有效反映河北省PRV感染的總體情況。程龍等[18]進(jìn)行邯鄲地區(qū)豬繁殖障礙病血清學(xué)調(diào)查時(shí)，對(duì)2019年從邯鄲地區(qū)26個(gè)豬場采集的864份血清進(jìn)行了gE抗體檢測，結(jié)果顯示342份呈現(xiàn)陽性，樣本陽性率為39.6%。26個(gè)豬場中，僅有3個(gè)為gE抗體陰性，場群陽性率為88.5%(23/26)，且23個(gè)陽性豬場的豬只感染情況差異很大，gE 抗體陽性率為25%～79%。本研究對(duì)來源于河北省195個(gè)不同規(guī)模豬場的10 479份血樣進(jìn)行了GE抗體的檢測和分析，結(jié)果顯示血清陽性率為50.05%，對(duì)不同地區(qū)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，所檢測的11個(gè)地市均有不同程度的感染，其中邢臺(tái)地區(qū)的陽性率最高，這與李桂霞等[17]檢測的結(jié)果相一致。對(duì)不同階段豬群進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)種豬群空懷母豬的gE抗體陽性率達(dá)到73.75%，由于本研究未對(duì)其他病原進(jìn)行檢測，因此，僅憑這一個(gè)指標(biāo)，尚不能直接說明母豬空懷就是由PRV引起，但是由于空懷母豬gE抗體的高陽性率，可以推測PRV感染在一定程度上導(dǎo)致了空懷率的升高。另外，本研究檢測到7周齡仔豬gE抗體陽性率(22.92%)較低，但11周齡陽性率已經(jīng)開始升高，17周齡陽性率達(dá)到55.73%，說明在7周齡時(shí)，豬群的感染率較低，而17周齡則存在較高的PRV感染，可能的原因是母源抗體中的gE抗體，隨著時(shí)間的延長，抗體水平逐漸降低，且仔豬疫苗免疫程序不合理，導(dǎo)致疫苗免疫效果較差，7周齡后仔豬感染PRV比例增高。目前育肥豬階段呼吸道病較多，可能也與PRV的感染有關(guān)。

對(duì)場群陽性率進(jìn)行分析的過程中，發(fā)現(xiàn)存欄50～300頭母豬的gE抗體陽性率高，有可能是這種規(guī)模群體的豬場，存欄量達(dá)到了一定數(shù)量，引種比存欄50頭母豬以下的豬場頻繁，但是與存欄300頭母豬以上的豬場相比，缺乏專業(yè)的技術(shù)人員，PRV防控技術(shù)薄弱，又由于檢測技術(shù)和檢測費(fèi)用等方面的原因，很少對(duì)豬群進(jìn)行血清和病原學(xué)的檢測和監(jiān)測，引進(jìn)PRV陽性豬的幾率較高，而且免疫后免疫效果不確實(shí)、群中存在的陽性個(gè)體或持續(xù)感染者不能及時(shí)篩除，導(dǎo)致PRV抗體陽性率較高。而800頭母豬以上的豬場，大部分注重引種時(shí)的檢測及豬群的定期監(jiān)測，因此，場群陽性率相對(duì)偏低。與2018年相比，2019年收集的血清gE抗體陽性率明顯降低，可能是由于自2018年8月，非洲豬瘟病毒在中國豬場的出現(xiàn)和不斷暴發(fā)，使豬場的生物安全意識(shí)增強(qiáng)，對(duì)進(jìn)出豬場的所有車輛、人員和物品均進(jìn)行嚴(yán)格的控制和消毒處理，定期對(duì)豬場及周邊環(huán)境進(jìn)行消毒，以及對(duì)引進(jìn)豬只進(jìn)行檢測等措施的實(shí)施，降低了PRV的感染機(jī)會(huì)，使gE抗體的陽性率下降，但場群陽性率仍較高，可能與豬場未及時(shí)對(duì)存在持續(xù)感染豬進(jìn)行清除有關(guān)，場群的高陽性率也說明河北省豬場PRV的防控形勢(shì)仍很嚴(yán)峻。

對(duì)收集的流產(chǎn)胎兒進(jìn)行PRV檢測的結(jié)果顯示，總陽性率為27.59%，說明PRV是導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)的一個(gè)重要病原因素，但不是唯一因素，可能其他能引起母豬流產(chǎn)的病原，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒等，在妊娠母豬流產(chǎn)過程起著更重要的作用。因此，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)河北省豬群其他病原流行情況的調(diào)查，并采取相應(yīng)的防控措施，以降低豬場的經(jīng)濟(jì)損失。

對(duì)PRV陽性病料中擴(kuò)增的gE基因進(jìn)行序列測定和分析，發(fā)現(xiàn)河北省豬場2018-2019年流行的PRV gE基因與國內(nèi)外2011年之前的毒株遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，與2012年之后的毒株相對(duì)較近，且與本實(shí)驗(yàn)室2012年從河北省分離獲得的4株P(guān)RV gE基因同源性較高。曾有研究表明[19]，PRV變異株與經(jīng)典毒株相比，在gE蛋白的第48位和第492位各存在1個(gè)天冬氨酸的插入，特別是第492位1個(gè)天冬氨酸的插入可作為鑒定PRV變異株的分子特征。本研究對(duì)從河北省檢測的8株P(guān)RV流行毒株及GenBank中不同分離年代和分離地域毒株的gE蛋白進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除HLJ(2013)和LA(1997)株外，其他毒株均符合該變異特征。河北省流行的8株P(guān)RV 均屬于變異毒株;另外，崔歡等[20]對(duì)從2017年河北省某豬場分離到的1株P(guān)RV進(jìn)行g(shù)E基因分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)gE基因也存在相同的變異特征,說明河北省近幾年流行的PRV 主要為毒力增強(qiáng)的變異毒株，這可能也是PRV 在疫苗免疫的豬場不斷發(fā)生的原因。

本試驗(yàn)通過對(duì)河北省不同地區(qū)、不同規(guī)模豬場的不同階段豬血清及流產(chǎn)胎兒進(jìn)行檢測，并對(duì)河北流行毒株的gE基因進(jìn)行了遺傳變異分析，初步了解了PRV在豬群中的流行和分布情況，以及河北省流行株的變異情況，為河北省PRV有效防控方案的制定提供了參考依據(jù)。