1株基因重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒的新型變異和遺傳進(jìn)化分析

胡 棟,朱迎春,趙 情,龐 恒,李傳剛,王亭亭,常維山,彭 軍*,吳家強(qiáng)

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，山東 泰安271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrom,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)及主要引起母豬流產(chǎn)的傳染病[1]。該病在臨床上主要導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎及病豬部分神經(jīng)性癥狀[2]。PRRSV于1987年首次在美國北卡羅來納州被發(fā)現(xiàn)[3]，后來經(jīng)分離確認(rèn)PRRSV傳播至歐洲。我國于1996年首次發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)該病，并迅速蔓延至全國，后來又經(jīng)2006年暴發(fā)“高熱病”以來，該病一直不斷發(fā)生，現(xiàn)已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重大疫病之一。PRRSV按基因的變異類型可劃分為以VR2332株為代表的經(jīng)典美洲型和以Lelystad Virus株為代表的經(jīng)典歐洲型和近來確認(rèn)的NADC30美洲型這三大基因型。PRRSV不同毒株主要是依據(jù)基因組的變異程度大小來進(jìn)行區(qū)分，其中以Nsp2和ORF5基因的變異程度最大，ORF3次之。對(duì)PRRSV經(jīng)典美洲型毒株和經(jīng)典歐洲型毒株的基因組進(jìn)行比較，以Nsp2所編碼的氨基酸的同源性約為40%，以O(shè)RF3所編碼的氨基酸的同源性約為55% ，而以O(shè)RF5所編碼的氨基酸的同源性約為53%。因此，對(duì)比不同毒株Nsp2、ORF3及ORF5基因的變異程度基本上可以反映出PRRSV整個(gè)基因組序列的變異情況[4]。

本試驗(yàn)所采集病料豬場的病豬在臨床表現(xiàn)出不同程度的精神沉郁、食欲減少、發(fā)熱、呼吸困難；懷孕母豬流產(chǎn)，部分豬舍母豬可達(dá)到60%左右的流產(chǎn)率，早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎現(xiàn)象嚴(yán)重；部分新生仔豬出現(xiàn)呼吸困難、運(yùn)動(dòng)失調(diào)及偏癱等癥狀且生長速度較其他無癥狀仔豬慢；少數(shù)仔豬耳部及體表皮膚有紫色點(diǎn)狀出血。剖檢病豬可見心肺部有大小不一的出血點(diǎn)、腎臟呈點(diǎn)狀出血、腸系膜淋巴結(jié)出血腫大、腹股溝淋巴結(jié)高度腫大且出血壞死。

通過采集山東泰安某疑似發(fā)病豬場發(fā)病豬的肺臟、淋巴結(jié)和血液等病料，經(jīng)臨床診斷及RT-PCR鑒定后，擴(kuò)增Nsp2、ORF3及ORF5基因并克隆測(cè)序，利用相關(guān)分子生物學(xué)軟件進(jìn)行對(duì)比并作遺傳進(jìn)化分析，以了解山東地區(qū)豬場豬群感染PRRSV基因遺傳變異的情況，為PRRSV基因的變異情況、流行病學(xué)研究和疫苗的研制等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理與病毒分離無菌采取山東省泰安市某豬場疑似PRRS發(fā)病豬的肺臟、肝臟、脾臟等病料組織，標(biāo)記編號(hào)后于-20℃冰箱保存。取少許疑似發(fā)病豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織置于研磨器中，加入1 ml滅菌PBS進(jìn)行研磨。將研磨充分的組織懸液反復(fù)凍融3次，4 000 r/min離心15 min，取上清液在0.22 μm的無菌濾膜中過濾除菌后，加入培養(yǎng)有MARC-145細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間觀察MARC-145細(xì)胞的狀態(tài)是否出現(xiàn)皺縮、聚集和脫落等狀態(tài)。

1.2 主要試劑MiniBest Viral RNA/DNA Extraction Kit 5.0、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker、E.coliDH5α Competent Cells等均購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)參考GenBank已收錄的PRRSV JXA1、VR2332、CH-1a等毒株核苷酸序列，通過DNAStar軟件分析對(duì)比，采用Primer 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)可以區(qū)分經(jīng)典毒株與高致病性毒株Nsp2基因的引物R1：5′-CAACACCCAGGCGACTTCA-3′，R2：5′-TGCGTAGCAGGATCACCAAG-3′,經(jīng)典毒株擴(kuò)增產(chǎn)物大小930 bp，高致病性毒株擴(kuò)增產(chǎn)物大小840 bp；擴(kuò)增ORF3全基因引物P1：5′-GTACTTTGGATCAGGTGTTTGC-3′，P2：5′-GTGACATTGGCAGTGATGGT-3′；擴(kuò)增ORF5全基因引物P3：5′-ATGAGGTGGGCAACCGTTT-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGGAA-3′。病毒全基因組擴(kuò)增引物序列如表1。引物送生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增PRRSV全基因組擴(kuò)增引物序列

1.4 PRRSV全基因組cDNA片段的RT-PCR擴(kuò)增以出現(xiàn)CPE的第2代MARC-145細(xì)胞的培養(yǎng)物為模板用于擴(kuò)增PRRSV全基因組cDNA。以2 μL RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄程序按照試劑盒說明書進(jìn)行獲得cDNA。PCR采用50 μL體系，其中取cDNA 4 μL作為模板，2×Taq Master Mix 24 μL，每個(gè)體系分別應(yīng)用9對(duì)引物(表1)的上、下游引物各1 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán);72℃再延伸7 min。取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，其余置4℃冰箱保存。

1.5 PRRSV Nsp2、ORF3和ORF5基因的PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系，其中取cDNA 4 μL作為模板，2×Taq Master Mix 24 μL，分別用擴(kuò)增Nsp2、ORF3和ORF5基因的上、下游引物各1 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 30s，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并置4℃冰箱保存。

1.6 目的基因的克隆測(cè)序?qū)δ康钠巫髂z回收并連接pMD18-T載體，反應(yīng)體系為pMD18-T載體1 μL、膠回收DNA 1 μL、緩沖液5 μL、ddH2O 2 μL。16℃反應(yīng)30 min后將其加入100 μL的JM109感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30 min，經(jīng)42℃加熱45 s后迅速放入冰中1 min，加入890 μL的SOC培養(yǎng)基并放入恒溫?fù)u床37℃振蕩培養(yǎng)60 min，之后將培養(yǎng)液均勻涂布在含有Amp的瓊脂板上培養(yǎng)過夜，挑取白斑接種于LB液體培養(yǎng)基，按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)序(上海生工)。

1.7 Nsp2、ORF3、ORF5基因的序列比對(duì)和分析先將測(cè)序結(jié)果通過NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)分析，找出部分同源性較高的毒株及國內(nèi)外錄入的代表毒株，再利用DNAStar、DNAman、MEGA等軟件對(duì)比分析。

1.8 細(xì)胞傳代后病毒Nsp2基因檢測(cè)將經(jīng)過傳代出現(xiàn)CPE的第5代和第10代分離毒株分別提取病毒RNA，擴(kuò)增Nsp2、ORF3和ORF5基因后送測(cè)序。

1.9 重組分析根據(jù)GenBank中登錄的參考序列，利用RDP4軟件對(duì)分離的SD18毒株進(jìn)行基因重組分析，篩選出親本毒株和提供重組片段的病毒株。根據(jù)RDP4軟件分析結(jié)果，利用SimPlot對(duì)SD18毒株進(jìn)行全基因序列重組分析。

1.10 GP5蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用在線軟件SignalP4.1中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法對(duì)SD18毒株的GP5蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離陽性病料組織上清接種初代MARC-145細(xì)胞即出現(xiàn)CPE，病變細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮、聚堆、拉網(wǎng)等狀態(tài)，而對(duì)照細(xì)胞無明顯變化(圖1)，然后對(duì)分離毒株繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

A.正常MARC-145細(xì)胞；B.病變MARC-145細(xì)胞

2.2 PRRSV分離株Nsp2基因擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增鑒定，得到840 bp大小的條帶，符合高致病性PRRSV條帶大小(圖2)。

2.3 Nsp2、ORF3、ORF5基因的PCR擴(kuò)增經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增Nsp2、ORF3、ORF5基因片段后，得到約1 066，872，737 bp的特異性條帶，與預(yù)期條帶大小相符(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對(duì)照；2.SD18毒株樣品；3.陰性對(duì)照

2.4 SD18毒株全基因組序列遺傳進(jìn)化樹將SD18毒株全基因組序列與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比較并繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果顯示PRRSV可分為美洲型毒株與歐洲型毒株2大類，且美洲型毒株又具有多個(gè)不同的亞種；SD18毒株為高致病性美洲毒株中的一個(gè)亞群，與早期國內(nèi)分離株CH-1a等經(jīng)典毒株相距甚遠(yuǎn)，PRRSV仍在不斷變異。該分離毒株已明顯區(qū)別于以JXA1、HUN4、TJ等為代表的高致病性中國分離株，形成一個(gè)新的獨(dú)立分支，這些變異提示該分離毒株很可能在病毒的編碼蛋白及其免疫原性等方面出現(xiàn)了較大變化(圖4)。

2.5 SD18毒株部分氨基酸序列分析

2.5.1Nsp2基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析 運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)SD18毒株Nsp2基因核苷酸及編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性分析表明，SD18毒株的Nsp2基因核苷酸序列與近幾年國內(nèi)常見高致病性毒株的同源性可達(dá)87.0%～91.2%(85.3%～90.2%)，與經(jīng)典美洲毒株VR2332同源性為72.0%(67.4%)，與國內(nèi)的HPBEDV毒株同源性為88.0%(81.2%)，與美國變異毒株NADC30同源性為74.7%(69.7%)，而與經(jīng)典歐洲毒株Lelystad Virus同源性為50.5%(30.2%)。SD18毒株的Nsp2基因編碼氨基酸序列分別在對(duì)應(yīng)VR2332毒株的830位和864位分別出現(xiàn)2個(gè)氨基酸的缺失，920～948位出現(xiàn)了29個(gè)氨基酸的連續(xù)缺失，其中第830位氨基酸位點(diǎn)是最新發(fā)現(xiàn)的缺失氨基酸。同時(shí)，Nsp2在690～894位也出現(xiàn)了多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異(圖5，表2)。

M.DL2000 DNA Marker；A1.SD18 Nsp2基因擴(kuò)增條帶； B1.SD18 ORF3基因擴(kuò)增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴(kuò)增條帶；A2,B2,C2.陰性對(duì)照

●表示本研究的分離毒株;▲表示重組毒株

圖5 SD18毒株與PRRSV參考株Nsp2基因編碼氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

表2 SD18毒株Nsp2基因編碼氨基酸突變位點(diǎn)

2.5.2ORF3基因核苷酸與編碼氨基酸序列分析 與國內(nèi)外的參考毒株進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，SD18毒株ORF3全基因與近幾年國內(nèi)高致病性毒株同源性可達(dá)87.6%～95.7%，與代表性高致病毒株CH-1a同源性為92.3%，與美國新型變異株NADC30同源性為82.5%，與歐洲經(jīng)典株Lelystad Virus同源性為64.8%。而在其編碼氨基酸方面，SD18毒株的ORF3在13，71，151，225，260等位點(diǎn)出現(xiàn)了與參考毒株相比不同程度的變異，在245，246和250～259位點(diǎn)出現(xiàn)了與其他高致病性毒株相同的缺失位點(diǎn)，主要變異情況見表3。

表3 SD18毒株ORF3基因編碼氨基酸突變位點(diǎn)

2.5.3ORF5基因核苷酸與編碼氨基酸序列分析 ORF5編碼氨基酸序列變異性分析顯示在18，30，40，44，63，100，107位點(diǎn)出現(xiàn)與其他毒株不同程度的變異(表4)。

表4 SD18毒株OR5基因編碼氨基酸突變位點(diǎn)

2.6 ORF5基因編碼產(chǎn)物抗原性分析與參考株ORF5基因抗原對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，SD18毒株ORF5編碼產(chǎn)物抗原表位主要集中在6～16，30～39，50～60，128～132，136～141，146～155，161～183 aa與WUH1毒株具有相似的抗原性特征，但與VR2332毒株差異性較大，主要差異在30～39 aa區(qū)域，相較于VR2332毒株,SD18毒株抗原區(qū)域明顯變窄，而在6～16，50～60，136～141 aa等區(qū)域，SD18毒株抗原性卻明顯高于VR2332毒株(圖6)。

圖6 PRRSV SD18毒株ORF5基因編碼產(chǎn)物抗原性預(yù)測(cè)分析

2.7 分離株傳代后Nsp2基因檢測(cè)擴(kuò)增出現(xiàn)CPE的第5代和第10代細(xì)胞SD18毒株的Nsp2、ORF3和ORF5基因并測(cè)序，結(jié)果顯示其基因序列并未發(fā)生改變，條帶大小也未見變化(圖7，8)。

M.DL2000 DNA Marker；A1.SD18 Nsp2基因擴(kuò)增條帶；B1.SD18 ORF3基因擴(kuò)增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴(kuò)增條帶；A2,B2,C2.陰性對(duì)照

M.DL2000 DNA Marker；1.SD18 Nsp2基因擴(kuò)增條帶；B1.SD18 ORF3基因擴(kuò)增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴(kuò)增條帶；A2,B2,C2.陰性對(duì)照

2.8 基因重組分析利用RDP4和SimPlot對(duì)SD18分離株和參考株的全基因組序列進(jìn)行重組分析,結(jié)果顯示SD18毒株在多個(gè)位置發(fā)生基因重組現(xiàn)象(表5,圖9)。SD18毒株的重組親本毒株為VR2332株，提供重組片段的病毒株為JXA1-R及NADC30-like毒株。

表5 以VR2332為親本的SD18分離株的重組信息分析結(jié)果

圖9 PRRSV SD18毒株的基因重組分析

2.10 GP5蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用軟件SignalP4.1在線分析功能，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測(cè)SD18毒株GP5蛋白的信號(hào)肽，該預(yù)測(cè)方法主要有3個(gè)參數(shù)，即S、C和Y值對(duì)應(yīng)每個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)結(jié)果中一條起伏較大的曲線表示S值的變化趨勢(shì)，在信號(hào)肽區(qū)域內(nèi)S值較高。C值為剪切位點(diǎn)值，在剪切位點(diǎn)處該值最高。Y值為綜合考慮S值和C值之后的參數(shù)，要比單獨(dú)考慮C值更精確。SD18毒株GP5蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖10所示，1～15 aa區(qū)域的S值較高且在12 aa處達(dá)到最高0.971，在32 aa處C值和Y值分別達(dá)到最高0.571和0.643，由此可知，SD18毒株GP5蛋白存在信號(hào)肽，其信號(hào)肽區(qū)域?yàn)?～31 aa，其剪切位點(diǎn)為31～32 aa。

圖10 SD18毒株 GP5蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

PRRSV自20世紀(jì)末傳入我國以來，給我國養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是2006年出現(xiàn)的高致病性變異毒株更對(duì)該病的防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[5]。該病威脅巨大的原因之一是病毒基因變異迅速，可以通過不斷的缺失、突變、重組從而極大地增加了病毒致病力的變異幾率[6]，導(dǎo)致原有疫苗對(duì)豬體產(chǎn)生的免疫保護(hù)力不足。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國目前流行的PRRSV仍是以高致病性美洲毒株為主[7-8]。隨著近幾年生豬貿(mào)易進(jìn)一步的擴(kuò)大以及各種弱毒疫苗的不合理使用，使得PRRSV毒株的遺傳變異更加趨于復(fù)雜化和廣泛化，其中Nsp2、ORF3和ORF5基因在影響PRRSV毒株的變異規(guī)律、對(duì)宿主感染前后的致病力和病原本身的免疫原性方面有重要的作用，具有較大的研究價(jià)值。因此，加強(qiáng)對(duì)PRRSV基因遺傳變化規(guī)律的監(jiān)測(cè)及分析，特別是對(duì)動(dòng)物機(jī)體和相關(guān)免疫程序的影響，對(duì)防控PRRSV具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

Nsp2作為PRRSV整個(gè)基因組中變異性最大的基因之一，其堿基序列的缺失、突變導(dǎo)致的某些氨基酸位點(diǎn)的變異可以作為監(jiān)視PRRSV基因組遺傳變化的一個(gè)重要標(biāo)志[9]。Nsp2基因的變化不僅表現(xiàn)在某些堿基位點(diǎn)的突變與缺失，更有不同長度的連續(xù)性缺失，如我國最早發(fā)現(xiàn)的Nsp2基因存在12個(gè)連續(xù)缺失的HB-2株[10]。另外由于2006年我國各地大規(guī)模的暴發(fā)PRRS，一種Nsp2基因出現(xiàn)了90個(gè)不連續(xù)堿基位點(diǎn)缺失的PRRSV被作為新型美洲高致病性PRRSV進(jìn)入了人們的視線[11]。根據(jù)不同的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，新型變異的PRRSV毒株Nsp2基因編碼氨基酸缺失位點(diǎn)數(shù)量正在呈不斷增加的趨勢(shì)[12]。由此可見，PRRSV的Nsp2基因變異程度高、缺失數(shù)目大，以及不同類型毒株之間的遺傳特性和抗原性的差異，使得新型突變病毒與原流行毒株之間的免疫交叉保護(hù)力較低，這或許是PRRSV難以有效防控的重要原因之一。相關(guān)研究顯示[13]，PRRSV Nsp2基因上存在與毒株致病力相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，即668位與952位氨基酸。本研究的SD18毒株Nsp2基因第668位氨基酸為R，與國內(nèi)分離的早期高致病性毒株JXA1、HUN4相同。同時(shí)SD18毒株在628，703，725，752等多個(gè)位點(diǎn)的突變均與高致病性毒株JXA1、HUB1相同，表明SD18毒株同樣為一株具有高致病性的強(qiáng)毒株。而在某些Nsp2基因氨基酸位點(diǎn)上，SD18毒株又與JXA1、HUB1表現(xiàn)出不同的變化，如在749(A→V)、780(M→V)、783(H→L)、844(V→A)等出現(xiàn)了突變，表明SD18毒株呈現(xiàn)向新型毒株變異的趨勢(shì)。

ORF3同樣為PRRSV變異性最大的基因之一，其遺傳變異也在一定程度上反映了PRRSV整個(gè)毒株的變異程度和流行趨勢(shì)[14]。有研究表明，由ORF3基因編碼的GP3蛋白具有較好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定水平的抗體，但與GP5的抗體水平相比較低[15]，這或許是由于GP3蛋白的抗原性主要誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫有關(guān)。相關(guān)研究證明，病毒蛋白中含有大量的糖基化蛋白，它們?cè)谧R(shí)別宿主特定的靶細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)與免疫逃避等方面具有重要作用[16-17]。GP3蛋白上存在許多與GP5蛋白具有相似功能的糖基化位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)均在整個(gè)病毒的免疫逃避中發(fā)揮著重要的作用。GP3蛋白上的糖基化位點(diǎn)主要有N30、N43、N51、N132、N153、N161和N196，而SD18毒株GP3蛋白的這7個(gè)糖基化位點(diǎn)均未發(fā)生氨基酸的變異，但在別的位點(diǎn)卻發(fā)生了多個(gè)氨基酸的變異。與國內(nèi)的高致病性代表毒株JXA1和HUB1比較，在20(F→L)、69(P→S)、71(K→N)、96(P→S)、147(V→D)、153(A→T)等氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)了變異，而無論與美洲經(jīng)典株或高致病性株相比，SD18毒株第17位氨基酸插入了1個(gè)氨基酸S。相關(guān)試驗(yàn)表明[18]，GP3蛋白在PRRSV感染受體細(xì)胞與病毒粒子裝配等方面發(fā)揮重要作用，而SD18毒株的ORF3基因這些氨基酸位點(diǎn)變異，是否會(huì)影響PRRSV的病原性與致病性還有待進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道，PRRSV疫苗株的GP5蛋白第137位為丙氨酸，而野毒株在該位點(diǎn)則是絲氨酸[19]。另外，可以通過GP5的13和151位的氨基酸變異情況來判斷毒株毒力的強(qiáng)弱[20]。通過對(duì)本試驗(yàn)SD18毒株ORF5所編碼的氨基酸分析表明，其137位為絲氨酸，符合強(qiáng)毒株特性之一，排除SD18毒株為疫苗株。對(duì)比SD18毒株與JXA1株等強(qiáng)毒株發(fā)現(xiàn)，在第13位與第151位氨基酸均為精氨酸，表明該試驗(yàn)分離的SD18毒株為野毒株。各項(xiàng)研究說明，GP5蛋白在病毒入侵機(jī)體時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗原性[21]，表明其在破壞機(jī)體細(xì)胞免疫的過程中發(fā)揮重要作用。此外，大部分PRRSV的中和位點(diǎn)均位于GP5蛋白上[22]，包括27～30，37～45，180～197 aa，而37～45 aa被認(rèn)為是發(fā)揮主要作用的位點(diǎn)。在上述位點(diǎn)中，起到識(shí)別中和抗體的位點(diǎn)分別為38,42,43,44 aa，而發(fā)揮結(jié)合中和抗體的位點(diǎn)則有39,40,41 aa[23]，以及剩余的2個(gè)誘騙位點(diǎn)，即當(dāng)機(jī)體感染PRRSV時(shí)，這2個(gè)誘騙位點(diǎn)會(huì)首先刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量針對(duì)其表位的非中和抗體，從而延緩了免疫系統(tǒng)針對(duì)主要抗原表位產(chǎn)生的中和抗體，使得有效的特異性抗體和病毒之間存在一定的時(shí)空差異。而與VR2332等經(jīng)典美洲高致病性毒株相比，SD18毒株的許多結(jié)合位點(diǎn)均發(fā)生了突變，首先第39位結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸(L→I)突變，其次第185位(V→A)也發(fā)生了突變，這2個(gè)中和位點(diǎn)的突變或許會(huì)影響PRRSV刺激機(jī)體生成中和抗體的敏感性，使得機(jī)體對(duì)病毒粒子的免疫清除能力受到影響，這也許是該分離株引起本次疾病暴發(fā)的原因之一。此外，GP5蛋白作為存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)的囊膜蛋白， 分別包括第30，33，34，35，44，51位氨基酸位點(diǎn)，而糖基化則會(huì)阻礙附近的中和抗原表位和中和抗體進(jìn)行結(jié)合。本試驗(yàn)分離的SD18分離株與經(jīng)典高致病性毒株VR2332相比則分別在34(D→N)、35(S→N)2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變，且突變的氨基酸種類一致，該糖基化位點(diǎn)的變化是否會(huì)影響病毒粒子中和表位的暴露以及其免疫逃避機(jī)制與致病力等都有待于進(jìn)一步的調(diào)查研究?？乖灾笖?shù)(antigenic index,AI)是將蛋白質(zhì)片段的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)、構(gòu)想與活動(dòng)性等多方面因素綜合考慮而建立的一種大致預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)不同區(qū)域抗原性的分析方法，AI值的高低在一定程度上反映了相關(guān)蛋白抗原性的高低，并與組成其抗原表位的可能性大小直接相關(guān)[24]。通過分析SD18毒株ORF5的抗原性表明，其部分抗原表位與HPBED具有較為相似的特征，而與VR2332有較大的差異，主要差異表現(xiàn)為SD18毒株在30～39 aa抗原區(qū)域變窄，而在50～60 aa及136～141 aa等區(qū)域則明顯高于VR2332株，這些AI的改變能否干擾毒株的致病力或影響不同PRRSV疫苗的免疫保護(hù)能力等都有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究?；蛑亟M一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一，揭示PRRSV的基因重組對(duì)了解PRRSV的流行性有較大的必要性。參照已有的方法，本研究利用RDP4和SimPlot對(duì)SD18毒株進(jìn)行重組分析，發(fā)現(xiàn)該株病毒在多個(gè)基因位點(diǎn)存在基因重組現(xiàn)象。SD18毒株以VR2332為親本，以疫苗株JXA1-R和國內(nèi)最新出現(xiàn)的NADC30-like毒株提供重組片段進(jìn)行基因重組，而重組的部位和數(shù)量不盡相同，重組大多發(fā)生在非結(jié)構(gòu)蛋白和次要結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域。該P(yáng)RRSV分離株由疫苗毒株提供的重組片段，提示弱毒疫苗株基因片段參與了病毒流行株的基因重組，這種現(xiàn)象應(yīng)該進(jìn)一步引起業(yè)界警惕而制定更合理的免疫計(jì)劃，避免PRRSV的進(jìn)一步變異。

綜上所述，本研究分離的SD18毒株與經(jīng)典毒株和高致病性毒株相比，其在Nsp2、ORF3和ORF5基因均出現(xiàn)了多處新的變異或缺失，包括Nsp2基因出現(xiàn)了不同于早期國內(nèi)分離的高致病性毒株新的缺失部位、GP3蛋白的多處糖基化位點(diǎn)發(fā)生了改變，而GP5表面抗體中和位點(diǎn)同樣也出現(xiàn)了多個(gè)突變，表明該病毒蛋白的免疫原性可能發(fā)生了改變，從而可能影響了病毒的致病性，引起疫苗免疫接種保護(hù)效果降低，這或許是該分離株引起本次PRRSV流行的最主要原因。本研究通過對(duì)SD18病毒的Nsp2、ORF3以及ORF5基因的遺傳變異分析，豐富了PRRSV的基因信息數(shù)據(jù)庫，同時(shí)也為PRRSV的突變趨勢(shì)、致病機(jī)理及對(duì)研制新型疫苗提供了科學(xué)參考資料。