1株非洲豬瘟病毒自然變異毒株的鑒定

張艷艷，張靜遠，楊金金，楊金梅，韓 桪，米立娟，張 菲，齊 宇，張守峰，王 穎，周鑫韜，岳慧賢，王述超，陳 騰，扈榮良

(軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的一種主要以家豬急性出血性疾病為特征的高感染率和高死亡率的烈性傳染病，主要臨床癥狀為發(fā)熱、厭食、腹瀉或便秘、臥地、皮膚發(fā)紺和全身性出血等。ASF于1909年首先發(fā)生于東非地區(qū)[1]，隨后擴散至歐洲、南美洲國家[2]，21世紀初擴散至東歐國家和地區(qū)[3]，但大部分國家均通過撲殺政策和嚴格的生物安全措施實現了家豬ASF的消除[4-5]，除了非洲地區(qū)和意大利薩丁島呈地方性流行以外，歐洲地區(qū)的野豬群中ASF自流行以來持續(xù)存在[6]。2018年8月，我國首次報告家豬ASF[7-8]，隨后在各省區(qū)相繼暴發(fā)疫情，流行速度較快，死亡率較高，曾一度導致我國生豬、豬肉及相關產品出現供應緊張局面。亞洲其他一些國家也陸續(xù)報道ASF流行情況[5]。目前，在我國ASF常態(tài)化防控政策下[9]，各養(yǎng)殖企業(yè)紛紛采取“拔牙”等方法控制疫情或采用高樓養(yǎng)豬、網格化管理等不同生物安全防范措施防止ASF發(fā)生。按照國家統(tǒng)計局和農業(yè)農村部發(fā)布的數據，至2020年9月，我國能繁殖母豬數量已達到3 822萬頭，能繁母豬逐漸恢復[10]。

經過2年流行，ASF疫情在我國大多數地區(qū)已不再呈現暴發(fā)式發(fā)生，流行趨勢逐漸放緩，但在不少地區(qū)出現了臨床癥狀表現趨多，死亡率逐漸降低，發(fā)病不易察覺等情況。

ASFV是一種線性的有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是唯一的媒傳DNA病毒[5]。病毒全基因組長170～194 kb[11-12]，變異程度較高。基因組編碼160多種蛋白。根據p72結構蛋白基因3′端序列可將ASFV分為24個基因型[13]，不同基因型或同一基因型的不同分離株毒力差異較大[14]，感染豬表現超急性型、急性型、亞急性型、慢性型和亞臨床感染癥狀[15]。在ASF呈現地方性流行的非洲和意大利薩丁島等地區(qū)均發(fā)現了不同基因型或不同毒力株，ASFV自然變異株不斷有報道，如OUR T88/3[16](Ⅰ型，低毒力)、NH/P68[17](Ⅰ型，低毒力)、Lv17/WB/Rie1[18](Ⅱ型，低毒力)、Estonia 2014[19](Ⅱ型，低毒力)都是從田間分離得到的自然變異株，這些毒株均殘留某種程度的毒力，可引起如關節(jié)炎、皮膚潰瘍等?？梢灶A測，隨著我國ASF流行時間的延長，ASFV自然變異株也將不可避免地陸續(xù)出現。

為了充分了解ASF在我國的流行特點，我們進行了ASF臨床調研，并開展了病原生態(tài)學監(jiān)測，在疫情流行特征與早期流行表現不同的地區(qū)的自由菜市場采集了樣品。采用世界衛(wèi)生組織(OIE)推薦的實時熒光定量PCR (qPCR)方法對組織樣品進行檢測，進而采用p72(B646L)及CVR、p30(CP204L)、EP153R-EP402R和MGF505-3R等基因引物對陽性樣品做進一步擴增和測序分析，并進行了病毒分離和全基因組測序。結果表明，我國可能已經出現了不同于早期ASFV流行株的毒力自然變異株。

1 材料與方法

1.1 細胞原代豬肺泡巨噬細胞(PAM)，無菌采自無豬源性病毒污染的家豬肺臟組織。

1.2 樣品帶骨的豬肌肉組織，分別購買自吉林、河北、湖北3個省的自由菜市場。

1.3 主要試劑Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)和Premix Ex Taq(Probe qPCR)為TaKaRa公司產品；RPMI 1640 培養(yǎng)基為Gibco公司產品；特級胎牛血清為呼和浩特草原綠野生物公司產品；裂解液由本實驗室自制；FITC-p30單克隆抗體由本實驗室制備。

1.4 主要儀器組織研磨儀為上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產品；Eco實時熒光定量PCR儀為Illumina公司產品。

1.5 樣品處理用滅菌的不銹鋼藥匙從帶骨豬肉的骨髓中刮取黃豆粒大小樣品，加入500 μL PBS(0.01 mol/L，pH7.2)，在組織研磨儀中研磨30 s(100次/s)，離心后取上清液備用。取50 μL上清液加入50 μL裂解液，沸水中5 min，12 000×g離心1 min，取上清進行后續(xù)PCR擴增。

1.6 引物qPCR和PCR擴增各基因所對應的引物信息見表1。

1.7 PCR擴增

1.7.1反應體系和反應條件 針對ASFV診斷時，采用OIE推薦的qPCR方法；針對p72、p30、CVR、EP153R-EP402R、MGF505-3R基因測序時，采用普通PCR方法。qPCR檢測出的陽性樣品需進一步進行普通PCR擴增和產物測序。qPCR和普通PCR反應體系均為20 μL：Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)或Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，滅菌蒸餾水補足至20 μL。qPCR反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30～150 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.7.2結果判定 qPCR結果判定：Ct值≤38 判為ASFV陽性，無Ct值判為陰性。38

PCR結果判定：PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，OIE-p72引物擴增產物出現278 bp、CVR引物擴增產物出現763 bp、p30引物擴增產物出現344 bp、MGF505-3R引物擴增產物出現357 bp、EP153R-EP402R引物擴增產物出現2 250 bp特異性條帶時，判定為陽性，否則，判為陰性。各引物擴增產物大小見表1。

表1 ASFV基因檢測引物信息

1.8 病毒培養(yǎng)和病毒特性測定

1.8.1病毒培養(yǎng) qPCR檢測為陽性和疑似陽性的樣品上清液，按5%比例接種原代PAM細胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96～120 h。培養(yǎng)過程中，每日顯微鏡下觀察。待細胞出現病變后，將細胞培養(yǎng)皿(瓶)在-20℃以下的低溫環(huán)境中凍融2次，分裝保存。

1.8.2病毒含量測定 將PAM細胞鋪于96孔板，2.5×106個/孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將0.1 mL 病毒液與0.9 mL細胞培養(yǎng)液混合，再取混合液0.1 mL與0.9 mL細胞培養(yǎng)液混合，依次獲得7個倍比稀釋液，每個稀釋度加入8個PAM細胞孔，每孔0.1 mL。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d后，使用80%冷丙酮、4℃條件下固定細胞30 min，棄丙酮，晾干，加入0.1 mL 工作濃度的FITC熒光標記的p30單克隆抗體稀釋液，在37℃避光孵育1 h；使用PBS(含0.5% Tween 20)洗滌3次，靜置3 min/次，熒光顯微鏡下觀察。病毒培養(yǎng)和含量檢測的操作均在BSL-3實驗室進行。

1.8.3血吸附特性 根據OIE推薦方法[20]，略作改良，采用原代PAM細胞進行血吸附特性試驗。簡言之，將100 μL PAM細胞鋪于96孔板，1×106個/孔，2 h后，將細胞培養(yǎng)物50 μL接種于PAM細胞(5 MOI)的96孔板上，同時設ASFV SY18毒株(本實驗室2018年分離自國內首次ASF疫情，為強毒株，具有血吸附特性)感染PAM細胞和正常PAM細胞對照。感染24 h后，將0.5%豬紅細胞按30 μL/孔加入96孔板，孵育0.5～3.0 d，顯微鏡下觀察。

1.9 擴增產物測序、全基因組測序、驗證和分析將普通PCR擴增的陽性產物送至吉林省庫美生物科技有限公司測序。利用在線網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對測序結果進行同源性搜索和比對，分析核苷酸序列的同源性。對新分離毒株的細胞培養(yǎng)物利用二代測序技術(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)進行病毒全基因組測序，與SY18毒株全基因組序列(MH766894.2)比對，分析新分離毒株是否出現其他變異位點。對于出現變異的核苷酸位點，根據其所在基因或核苷酸片段位置兩側的核苷酸序列合成引物，同上方法PCR擴增后送吉林省庫美生物科技有限公司測序進行驗證，以確定突變。

2 結果

2.1 PCR檢測結果自吉林、河北、湖北3個省共隨機購買帶骨豬肉樣品127份，通過qPCR方法檢測到4份陽性樣品。進一步采用p72(B646L)、p30(CP204L)、EP153R-EP402R、MGF505-3R基因引物進行擴增，其中，2～4號樣品的p72(B646L)、p30(CP204L)、MGF505-3R、EP153R-EP402R基因的擴增條帶大小和測序結果與SY18毒株的完全一致。而樣品1中其他基因大小和序列與SY18毒株完全一致，但EP153R-EP402R基因的擴增條帶大小與SY18毒株明顯不同，擴增產物經過測序，其EP153R-EP402R基因均發(fā)生部分缺失，共缺失1 252 bp。

M.DL5000 DNA Marker;P.ASFV SY18毒株;1～4.樣品1～4

2.2 病毒分離及生長特性利用PAM細胞針對樣品1進行了分離培養(yǎng)，結果接種的PAM細胞出現了細胞腫脹、空泡等細胞病變，獲得P1～P6代次細胞培養(yǎng)物，且第2，3代病毒含量分別為103.5，106.75TCID50/mL，隨后逐漸升高，第6代時病毒滴度達107.25TCID50/mL，與SY18毒株細胞培養(yǎng)的病毒含量相似。

2.3 全基因組測序及驗證結果分析通過第2代測序技術，對第6代細胞培養(yǎng)物提取基因組進行測序，獲得ASFV基因組總長為188 643 bp。與國內提交GenBank的全部ASFV毒株相比，新分離毒株的基因組核苷酸變化主要表現在3個方面的差異：(1)發(fā)生EP153R基因和EP402R基因的部分大片段缺失，該區(qū)域與國內ASFV毒株的比對結果見圖2，可以看出，EP153R基因為3′端部分缺失，CD2v為5′端部分缺失，缺失總長度為1 252 bp。(2)在多個基因編碼區(qū)和基因間隔區(qū)出現堿基突變、缺失或插入(表2)，這些突變和國內已經發(fā)表的10個ASFV毒株基因組中的堿基均不相同，具有本毒株特異性，其中部分突變導致編碼氨基酸的改變乃至開放閱讀框(ORF)的改變，后者包括多肽鏈的截短或延長，或失去編碼蛋白的功能。(3)基因組3′末端503 bp串聯重復片段的插入，與國內毒株比對結果見圖3。

基于以上結果，故認為該毒株為我國ASFV的1個新變異株，故將其命名為HuB20株。與ASFV SY18毒株相比，其基因組結構簡圖如圖4所示。

2.4 血吸附特性HuB20株和ASFV SY18毒株分別感染PAM細胞 24 h后，在96孔板接種細胞的每孔中加入30 μL 0.5%豬紅細胞懸液，繼續(xù)放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，感染ASFV SY18毒株的PAM細胞即出現了紅細胞吸附現象，感染HuB20株的PAM細胞和正常細胞未觀察到紅細胞吸附。至加入紅細胞72 h，感染HuB20株的PAM細胞和正常細胞仍無紅細胞吸附(圖5)。

3 討論

自2020年初以來，我國ASF不再呈大規(guī)模暴發(fā)流行，多表現疫情減緩，臨床癥狀不明顯，發(fā)病豬場死亡率30%～40%。根據農業(yè)農村部通報，2020年下半年以來，我國ASF疫情僅有零星發(fā)生，說明我國ASF的大流行可能已經過去。由于一些疫情發(fā)生地ASF臨床癥狀大多不明顯，死亡率不高，與急性型ASF相比，在流行早期難以發(fā)現，采用之前的所謂“拔牙”等手段很難將ASF清除，場內感染較難控制。本實驗室根據承擔的課題任務開展了ASFV的主動監(jiān)測，在我國某些ASF疫情發(fā)生地區(qū)的自由菜市場購買了帶骨的豬肉樣品，經檢測證明樣品具有一定比例的帶毒率。本研究中鑒定的自然變異毒株，其樣品來自湖北某地，但由于樣品來源于集市，故具體發(fā)病豬場不詳,不能完全排除其來源于進口豬肉的可能。根據我們在當地詢問的情況，樣品來源地為ASF流行緩慢、病死率較低的地區(qū)。針對該毒株毒力的驗證研究正在進行中。

p72基因末端的測序結果表明，4個陽性樣品均為ASFV基因Ⅱ型，p72、p30等基因序列未發(fā)生改變，但其中樣品1(命名為HuB20株)CD2v和EP153R基因處發(fā)生了缺失。從缺失的位點來看，CD2v為5′端部分缺失，其上游的EP153R基因也發(fā)生了3′端部分缺失，缺失總長度為1 252 bp。這和目前已知實驗室在研疫苗的CD2v缺失區(qū)域不同，在該處無熒光蛋白基因插入或人為設計的核苷酸序列。為了對該流行株進行更為全面的分析，我們開展了全基因組二代測序。與國內提交的不同株ASFV的全基因組比對后發(fā)現，該毒株有多處獨有的堿基變化。除了在EP153R、CD2v處發(fā)生缺失外，第2個明顯的變化是位于基因組3′末端的503 bp串聯重復序列的插入，該插入片段與國內毒株Wuhan2019-1基因組5′末端的部分序列高達77%同源性，與國內其他毒株基因組3′末端達28%同源性，與很多國外ASFV基因組的兩端序列高度同源，有的高達96%；第3個明顯的變化是在A238L、I9R等多個基因的編碼區(qū)出現堿基突變、缺失或插入，導致編碼氨基酸的改變乃至開放閱讀框變化。這些缺失、插入、突變是否和國內報道的疫情狀況相關聯，需要進一步通過動物試驗進行驗證。

灰色區(qū)域為同源性100%，藍色區(qū)域為無同源性；虛線區(qū)域為HuB20株獨有序列，與其他序列無同源性

該自然變異株體外表型的變化導致其血吸附特性喪失。ASFV的血吸附特性據報道與CD2v有關。CD2v由EP402R基因編碼，與T細胞CD2黏附受體同源，直接參與了ASFV在感染細胞中誘導的血吸附現象[22]。EP153R基因的表達產物C型凝集素由153個氨基酸組成，包含1個中央跨膜區(qū)、1個C型動物凝集素樣結構域和1個細胞附著(RGD)序列，與人及動物CD44分子氨基酸序列具有較高同源性。有報道認為，CD2v的血吸附特性的穩(wěn)定性似乎與C型凝集素有關聯[23]。文獻中報道的血吸附特性喪失的自然變異株包括NH/P68、OUR T88/3、Lv/17/WB/Rie1等。其中，OUR T88/3是2004年從西班牙豬場軟蜱中分離得到的，為基因Ⅰ型，其缺失核苷酸片段較大，與本自然變異株不屬于同一基因型[24]。NH/P68為慢性感染豬場中分離到的1株弱毒，也是基因Ⅰ型，其血吸附特性的喪失是因CD2v基因中堿基突變導致讀框發(fā)生移位所致[17]。Lv/17/WB/Rie1株是2017年從野豬體內分離到的一個基因Ⅱ型的自然弱毒株，無血吸附特性，則是由1個核苷酸缺失導致讀框移位提前終止所致[18]。本變異株血吸附特性的喪失與國外報道的毒株均不一樣，是因基因片段的缺失所致。因此，據我們所知，本變異株(HuB20株)應為我國境內首次出現和鑒定的無血吸附特性及毒力可能致弱的自然變異株。

灰色區(qū)域為所有毒株同源性100%，藍色區(qū)域為HuB20株獨有序列;虛線區(qū)域為其他毒株同源區(qū)域

表2 HuB20株單(或多重)核苷酸變異統(tǒng)計表

續(xù)表2

圖4 新分離ASFV HuB20株與國內毒株基因組差異

圖5 ASFV HuB20變異株和SY18毒株血吸附結果

HuB20株在體外的復制能力未受到影響。GLADUE等[25]在ASFV-G-Δ9GL基礎上對CD2v和EP153R進行缺失，缺失毒的生長曲線顯示，ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v/ΔEP153R在PAM細胞中復制能力低于ASFV-G-Δ9GL和ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v，后兩者的復制能力無差異，三者的復制能力均低于親本毒株Georgia 2007；說明9GL和EP153R基因對病毒復制可能具有重要影響。但本實驗室在對HuB20株培養(yǎng)過程中發(fā)現，最初3代病毒繁殖滴度較低，后期病毒增殖滴度和SY18毒株沒有明顯差別，在沒有9GL基因缺失的情況下，EP402R、EP153R的聯合缺失對于病毒的復制并未產生明顯影響。但由于本變異株中存在多處堿基變化，不能排除其他基因的改變對本病毒的體外復制產生了有利影響。

自然變異株的產生，可能系多方面原因促成。首先，我國生豬養(yǎng)殖基數大，品種多，ASFV在不同種群中長期存在，為病毒在不同易感性豬品種內的適應和變異提供了機會；第二，隨著ASF大流行的過去，耐過豬數量增多，在抗體和免疫選擇的壓力下，病毒出現變異是可能的；第三，ASFV本身的特性決定了其易變的可能。其基因組長度變異較大，不同毒株為170～194 kb，一般認為其中間125 kb為恒定區(qū)，左側38～47 kb和右側13～15 kb為可變區(qū)，病毒自然發(fā)生變異的頻率較高[26]。本研究證明的自然變異株僅為我國某一地區(qū)的分離株，可能是眾多變異株中的1株，不能排除在我國其他地區(qū)出現了其他變異株的可能。因此，有必要加強監(jiān)測，根據流行和變異株的特征來調整和確定防控策略。

另外，根據ASFV的遺傳特性，在不實行撲殺的常態(tài)化疫情防控措施下，尤其是目前很多養(yǎng)殖場通過“拔牙”的方法，或使用免疫增強藥物，或使用基因工程改造的微生態(tài)制劑以及試圖使用治療藥物控制疫情的情況下，都將會隨著流行時間的延長以及對野毒株流行的“縱容”，加速變異株的產生。因此，加強對ASF流行病學和分子流行病學的監(jiān)測，應當是我們每個獸醫(yī)從業(yè)者尤其是研究人員的責任。

自然變異株的出現，都是病毒為了自身更好地生存而作出的繁殖策略的改變，與體內復制有限、不能水平傳播的人工缺失致弱株相比，自然變異株在豬體內更容易生存和繁殖，也更容易在豬群中散播。自然變異株由于致病力發(fā)生一定程度減弱，其傳播不易引起注意，更容易造成大面積擴散，對其根除也將變得困難。因此，其危害性與引起最急性和急性型癥狀的強毒株相比更加隱蔽，因而更加廣泛和嚴重，值得我國養(yǎng)豬行業(yè)的關注。應當毫不猶豫地清除自然變異株感染豬群，只有這樣，通過生物安全清除ASF才不是空談。