白花丹醌對人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞凋亡、自噬及PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響*

劉 歡， 梁麗英， 劉 顯， 藍(lán)艷梅， 呂貝貝， 陳婉君， 韋燕飛△

（廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧530024）

近年來結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率逐漸升高，且具有低齡化趨勢［1］。由于副作用及耐藥性的影響，現(xiàn)行化療藥物對晚期結(jié)腸癌的治療效果不夠理想［2］。因此，尋找潛在的抗腫瘤藥物便成為結(jié)腸癌研究的重點(diǎn)之一。

白花丹醌（plumbagin，PLB）是傳統(tǒng)民族藥材白花丹的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示白花丹醌抗腫瘤作用明顯，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移［3］，但是具體的機(jī)制尚不清楚。已有的研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與自噬是白花丹醌體外抗腫瘤作用機(jī)制之一［4］。有研究指出自噬對于細(xì)胞具有雙重作用，一方面可以保護(hù)細(xì)胞，另一方面也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡［5］。而白花丹醌對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用及其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑未見明確報道。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosi?tol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian tar?get of rapamycin，mTOR）信號通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、自噬和代謝等多個生物學(xué)過程。大量研究發(fā)現(xiàn)多種天然活性成分是通過靶向PI3K/Akt/mTOR 信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用的，靶向該通路誘導(dǎo)的自噬可作為腫瘤治療及增強(qiáng)化療敏感性的重要手段［6］。那么白花丹醌對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外的抑制作用與細(xì)胞凋亡、自噬及PI3K/Akt/mTOR 信號通路之間的關(guān)聯(lián)有待我們進(jìn)一步的研究。

因此，本項工作以人結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞作為研究對象，體外觀察白花丹醌對細(xì)胞活力、凋亡和自噬的影響，并探究其對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響，為白花丹醌抑制結(jié)腸癌的分子機(jī)制提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)試劑 人結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞系由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。白花丹醌（P7262）購自Sigma-Aldrich；MTT 檢測試劑盒購于上海碧云天生物有限公司；細(xì)胞凋亡annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒購于BD；微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-asso?ciated protein 1 light chain 3，LC3）雙熒光（RFP-GFP）腺病毒購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；MEM 液體培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%EDTA胰酶和青-鏈霉素雙抗混合液購自Gibco。

1.2 抗體及其他試劑 兔抗LC3-II 單克隆抗體（ab192890）、兔抗PI3K 單克隆抗體（ab151549）和兔抗p62 單克隆抗體（ab56416）均購自Abcam；兔抗be?clin-1 抗體（#3738）、兔抗cleaved caspase-3 抗體（#9664）、兔抗剪切的多腺苷二磷酸核糖聚合酶1［cleaved poly（ADP-ribose） polymerase 1，cleaved PARP1］抗體（#5625）、兔抗Bcl-2 抗體（#3498）、兔抗Akt 抗體（#4685）、兔抗mTOR 抗體（#2983）和兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy?drogenase，GAPDH）抗體（#5174）均購自CST；PVDF膜和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore；GoScript?Reverse Transcription Mix 和GoTaq?qPCR Master Mix均購自Promega。所用引物由上海生工生物公司合成，序列見表1。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞用含青霉素（1×105U/L）、鏈霉素（0.1 g/L）和20% FBS 的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待細(xì)胞長滿后使用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，隨后按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT 檢測 胰酶消化收集Caco-2 細(xì)胞，按每孔2 000 個細(xì)胞（每孔100 μL）鋪于96 孔板，37℃培養(yǎng)過夜。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，更換為分別含有2.5、5、7.5、10、12.5 和15 μmol/L 白花丹醌的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時以DMSO 為對照組，每個作用濃度設(shè)6 個重復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24 和36 h 后，在每孔加入10 μLMTT 溶液（5 g/L），37℃孵育4 h。孵育結(jié)束后吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO（每孔150 μL）并于37℃孵育1 h，測定各孔內(nèi)490 nm波長的吸光度。

表1 本研究所用引物的序列Table 1. The sequences of the primers used in this study

2.3 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞傳代至6 孔板，待細(xì)胞貼壁后更換含有5、10和15 μmol/L白花丹醌的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。使用胰酶消化、離心收集細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液；隨后參照凋亡檢測試劑盒說明書，經(jīng)細(xì)胞洗滌、重懸、annexin V-FITC標(biāo)記和PI染色后，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。每組設(shè)3 個重復(fù)組，同時以DMSO作為對照組。

2.4 自噬流檢測 將細(xì)胞鋪于6 孔板，過夜培養(yǎng)后接種感染復(fù)數(shù)（multiply of infection，MOI）=1 000 的自噬LC3-雙熒光（GFP-RFP）標(biāo)記腺病毒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡觀察腺病毒感染效率，當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)熒光信號時，更換含有10 μmol/L 白花丹醌的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，以DMSO作為對照。白花丹醌處理完成后，觀察兩組細(xì)胞綠色（GFP）和紅色（RFP）熒光信號，拍照保存結(jié)果。

2.5 間接免疫熒光檢測 將Caco-2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)于24 孔板，待細(xì)胞生長至60%左右時，更換含有10 μmol/L白花丹醌的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時設(shè)置對照組。處理結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，使用-20℃預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，使用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS緩沖液室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，隨后4℃過夜孵育LC3-II 抗體。Ⅰ抗孵育結(jié)束后，PBS洗滌3次，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育40 min，PBS洗滌3次后置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.6 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬形態(tài) 將Caco-2 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至80%左右時，更換含10 μmol/L 白花丹醌的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時設(shè)置對照組。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并迅速加入2.5%戊二醛固定液（索萊寶，P1126），使用細(xì)胞刮沿同一方向輕輕刮取細(xì)胞并收集到離心管。固定4 h之后，用丙酮和乙醇將細(xì)胞脫水，經(jīng)樹脂包埋和超薄切片后，使用透射電鏡（HT7800 120 kV）觀察亞細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)并拍照保存結(jié)果。

2.7 RT-qPCR 檢測 使用白花丹醌（5、10 和15 μmol/L）處理Caco-2 細(xì)胞24 h，Trizol 法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR。參照PCR 試劑盒說明書，配制20 μL 的反應(yīng)體系：10 μL GoTaq?qPCR Master Mix（2×），上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板2 μL，6 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，計算各反應(yīng)Ct 值，以GAPDH 作為參照，使用2-ΔΔCt法計算結(jié)果，進(jìn)行組間比較分析。

2.8 Western blot檢測 將Caco-2細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞生長至單層后更換含有不同濃度（5、10和15 μmol/L）白花丹醌的MEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個濃度設(shè)3 重復(fù)孔。吸棄上層培養(yǎng)液，使用RI?PA 裂解液（每孔300 μL）于冰上裂解細(xì)胞30 min，小心刮取細(xì)胞裂解液，12 000×g 離心10 min 后收集上清，-80℃保存?zhèn)溆?。使用BCA法測定樣品內(nèi)總蛋白濃度，并添加SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水浴10 min。使用15%的SDS-PAGE 分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用含5%脫脂乳的TBST 緩沖液室溫封閉PVDF 膜1 h。封閉后，分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗，4℃孵育過夜；TBST洗滌PVDF膜3次，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗1 h。Ⅱ抗孵育結(jié)束后，TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，使用GE AI600成像儀拍照保存化學(xué)發(fā)光結(jié)果。使用ImageJ 軟件（NIH）分析各目的條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參照，計算目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值，比較各組蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖分析。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT檢測結(jié)果

MTT 檢測結(jié)果顯示，不同濃度的白花丹醌均能夠抑制Caco-2細(xì)胞活力；與對照組相比較，作用濃度越高，抑制效果更顯著（P＜0.05），見圖1A。統(tǒng)計結(jié)果顯示，白花丹醌作用12、24 和36 h 的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為13.36、7.387 和3.222 μmol/L。同一作用濃度，隨著作用時間的延長，抑制效果更強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖1B。

Figure 1. Influence of plumbagin（PLB）on Caco-2 cell viabili?ty. A：MTT assay result；B：statistical analysis result of MTT assay. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05 vs 12 h group；△P＜0.05 vs 24 h group.圖1 白花丹醌對Caco-2細(xì)胞活力的影響

2 細(xì)胞凋亡檢測

與對照組相比，白花丹醌作用后，Caco-2細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)作用濃度為15 μmol/L時，細(xì)胞的凋亡率達(dá)到了55%以上（圖2）。

3 透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞具有完整的細(xì)胞核和核膜，核膜邊緣清晰完整，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)中可見少量自噬小體（圖3A～C）。而白花丹醌作用后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，核膜邊緣出現(xiàn)凹陷、崩塌，質(zhì)膜崩解，在細(xì)胞核周圍出現(xiàn)自噬小體（圖3D～F）。

4 自噬流檢測

Caco-2 細(xì)胞在感染雙熒光標(biāo)記腺病毒后48 h，80%以上細(xì)胞出現(xiàn)紅、綠色熒光，提示腺病毒感染效率符合實驗要求。白花丹醌處理12 h 后，同一視野下紅、綠色熒光疊加后細(xì)胞內(nèi)紅色、黃色斑點(diǎn)數(shù)目增多（圖4）。

5 間接免疫熒光檢測檢測結(jié)果

間接免疫熒光檢測檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，白花丹醌處理組綠色熒光細(xì)胞比例增高，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)增多，且多聚集在細(xì)胞核周圍（圖5）。

6 RT-qPCR結(jié)果

與對照組相比，白花丹醌可顯著抑制PI3K、Akt及mTOR 的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），而Map1lc3b及BECN1 的mRNA 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），其中Map1lc3b 的mRNA 表達(dá)上升尤為顯著（P＜0.01），見圖6。

Figure 3. Transmission electron microscopic results of Caco-2 cells treated with plumbagin. A～C：DMSO control；D～F：cells treated by plumbagin at 10 μmol/L for 12 h. The scale bars are 5 μm for A and D，1 μm for B and E，and 500 nm for C and F.The arrows indicate autophagosomes.圖3 白花丹醌處理CaCo-2細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果

Figure 4. Autophagy flux detection of Caco-2 cells treated with plumbagin for 12 h. A～C：cells treated with plumbagin at 10 μmol/L for 12 h；E～F：DMSO control. Scale bar=100 μm.圖4 白花丹醌處理CaCo-2細(xì)胞內(nèi)自噬流檢測

7 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果表明，白花丹醌作用后，細(xì)胞 內(nèi)LC3-II、cleaved caspase-3、cleaved PARP1、be?clin-1 和p62 的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與此同時，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、PI3K、Akt 和mTOR 的蛋白表達(dá)水平顯著降低，與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），見圖7、8。

討 論

1 白花丹醌與細(xì)胞凋亡和自噬

細(xì)胞凋亡是一個多因素參與的細(xì)胞程序性死亡過程。而腫瘤細(xì)胞的特征之一是缺乏這種程序性死亡過程，那么誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡就成為防治腫瘤的一種手段。在結(jié)腸癌，白花丹醌可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116、HCT15 和HT29 等細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［7-8］，而白花丹醌對Caco-2細(xì)胞的作用有待研究確認(rèn)。本實驗結(jié)果顯示，白花丹醌作用于Caco-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)志蛋白cleaved caspase-3 和cleaved PARP1 表達(dá)水平升高，提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是白花丹醌抑制結(jié)腸癌的重要機(jī)制之一。

Figure 5. Indirect immunofluorescence assay for LC3 expression in Caco-2 cells treated with plumbagin. A～C：cells treated with plumbagin at 10 μmol/L for 12 h；D～F：DMSO control. Scale bar=100 μm.圖5 白花丹醌對CaCo-2細(xì)胞LC3表達(dá)的影響

Figure 6. RT-qPCR result. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖6 RT-qPCR檢測結(jié)果

自噬在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，而對于腫瘤細(xì)胞，自噬具有雙重作用，一方面誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡從而抑制腫瘤的發(fā)生；而另一方面可對外部刺激起到保護(hù)性作用，因而又可稱為保護(hù)性自噬［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌刺激后細(xì)胞內(nèi)自噬流水平升高，LC3表達(dá)量升高，說明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的自噬反應(yīng)。作為細(xì)胞內(nèi)兩種常見的程序性死亡方式，細(xì)胞凋亡與自噬常常共同存在于一個細(xì)胞內(nèi)，但是兩者的作用和功能卻相互影響、制約和平衡，可在不同的情況下產(chǎn)生不同的結(jié)果［10］。細(xì)胞凋亡與自噬雖然具體的調(diào)控方式不同，但二者之間存在合作、對抗和推動三種交互作用關(guān)系［5］。前期研究顯示，白花丹醌作用于肝癌和前列腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)凋亡和自噬水平均顯著上升［11-12］。根據(jù)本研究結(jié)果，白花丹醌作用后細(xì)胞凋亡與自噬水平均顯著升高，提示在這一過程中凋亡與自噬之間可能為合作關(guān)系，共同引發(fā)Caco-2細(xì)胞程序性死亡。

Figure 7. Effects of plumbagin（PLB）on the expression of apoptosis- and autophagy-related proteins in Caco-2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖7 白花丹醌對Caco-2細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 8. Effects of plumbagin（PLB）on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in Caco-2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖8 白花丹醌對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

2 白花丹醌對Caco-2 細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR 信號通路信號通路的影響

PI3K/Akt/mTOR 信號通路主要通過調(diào)控下游多種效應(yīng)分子而發(fā)揮抗凋亡、促增殖等關(guān)鍵作用，提示對于PI3K/Akt/mTOR 通路異常激活的腫瘤細(xì)胞而言，該通路可作為抑制腫瘤靶點(diǎn)之一。越來越多的研究表明，包括白花丹醌在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物活性成分可調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬［13-15］。Liu 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬；在使用PI3K/Akt 或者mTOR 抑制劑時，細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高。本研究結(jié)果顯示，白花丹醌作用后，Caco-2 細(xì)胞內(nèi)自噬水平上升，同時PI3K/Akt/mTOR 信號通路顯著下調(diào)，提示白花丹醌誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制與姜黃素相似。

綜上所述，白花丹醌可顯著誘導(dǎo)結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞凋亡和自噬，其具體的分子機(jī)制可能是抑制PI3K、Atk 和mTOR 蛋白表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路。