正交試驗(yàn)法優(yōu)選光明護(hù)眼凝膠膏貼劑中總黃酮類(lèi)成分提取工藝

司云珊 翟宏業(yè) 王 玉 馬 力 耿 琍

吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000

光明護(hù)眼凝膠膏貼劑是由青箱子和決明子等組成，具有清熱明目、清利頭目、明目退翳作用，用于緩解視疲勞癥狀（又稱(chēng)視疲勞綜合征，visual display terminal，VDT）的保健用品。視疲勞又稱(chēng)眼疲勞，是一種眼科常見(jiàn)病，其所引起的眼干、眼澀、眼酸脹、視物模糊甚至視力下降直接影響著人的工作與生活。眼疲勞主要是由于人們平時(shí)全神貫注看電視，電腦等電子產(chǎn)品屏幕時(shí)眼睛眨眼次數(shù)減少，閃爍屏幕強(qiáng)烈刺激眼睛而引起的，眼疲勞還會(huì)引發(fā)和加重各種眼病[1]?？傸S酮提取和含量測(cè)定方法的研究一直是植物復(fù)方總黃酮研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，傳統(tǒng)的提取法有回流提取法、超聲波提取法等，還有醇類(lèi)提取法、堿液提取法、系統(tǒng)溶劑提取法、微波加熱提取法。測(cè)定法有紫外分光光度法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法。紫外分光光度法相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷、價(jià)格低廉，樣品又可回收使用，是鑒定總黃酮類(lèi)化合物的一種重要手段，筆者擬在考察影響總黃酮提取率單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，為復(fù)方的綜合利用提供依據(jù)。本研究采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選光明護(hù)眼凝膠膏貼劑的提取工藝[2]，為本方進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成凝膠膏劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尤尼柯UV2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器公司）；Rephile一體式超純水機(jī)（Rephile Bioscience公司）；KQ-100DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YP1002－電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Al204電子天平（上海越平儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FW100小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，100080-201408）。乙醇（北京化工廠，分析純）；亞硝酸鈉（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用藥材由長(zhǎng)春中東健康萬(wàn)家藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，各藥材依照《2015版中華人民共和國(guó)藥典》項(xiàng)下規(guī)定自檢接符合規(guī)定，為本文實(shí)驗(yàn)過(guò)程用藥。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱(chēng)定90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含0.63 mg蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

精密量取蘆丁對(duì)照品5 ml，樣品溶液1ml，蘆丁加入10 ml甲醇再加1%三乙胺溶液定容至25 ml，樣品溶液加入7 ml純化水，再加1%三乙胺溶液定容至25 ml。以溶液為空白，在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均在360 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明在此試驗(yàn)條件下測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為360 nm，故本實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)為360 nm。

圖1 蘆丁紫外-可見(jiàn)吸收全波長(zhǎng)掃描圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.298 mg于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此溶液于10 ml容量瓶中，配成濃度為0、5、10、15、20、25 μg/ml的樣品。精密量取各濃度的蘆丁對(duì)照品溶液2 ml置于25 ml容量瓶中，加10 ml甲醇，再加1%的三乙胺溶液定容至25 ml，以溶劑為空白，在360 nm處測(cè)吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。線性回歸方程為y=0.029x-0.019，相關(guān)系數(shù)r=0.9989，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在濃度為0～25μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[橫坐標(biāo)為樣品濃度（C） 縱坐標(biāo)為吸光度值（Abs）]

2.4 光明護(hù)眼凝膠膏貼劑工藝篩選正交試驗(yàn)及結(jié)果

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)提取溫度的確定 文獻(xiàn)調(diào)研得知，乙醇的沸點(diǎn)在75～80℃，隨著溫度升高總黃酮溶解性增強(qiáng)，所以單次實(shí)驗(yàn)提取溫度選擇為75℃。

2.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)過(guò)程提取時(shí)間的選擇 用粉碎機(jī)將復(fù)方粉碎，均分成3份，每份稱(chēng)取1 g左右，在80%的乙醇中75℃溫度下回流提取30、60、90 min三個(gè)時(shí)間，測(cè)其黃酮含量，提取時(shí)間考察結(jié)果總黃酮提取率分別為0.073%、0.116%、0.137%。

2.4.3 單因素實(shí)驗(yàn)過(guò)程乙醇提取濃度的篩選 將復(fù)方粉碎后均分成5份，每份稱(chēng)取1 g左右，分別取50 ml 50%、60%、70%、80%、90% 的三種不同濃度乙醇中，在75℃下回流提取提取40 min。測(cè)其黃酮含量。結(jié)果總黃酮提取率分別為0.052%、0.068%、0.117%、0.165%、0.143%。

2.4.4 單因素實(shí)驗(yàn)過(guò)程乙醇提取體積的確定 將復(fù)方粉碎，均分成3份，每份稱(chēng)取1 g左右，分別加入 80% 的乙醇 10、15、20 ml，提取結(jié)束后，75 ℃下回流提取 30 min。測(cè)其黃酮含量?？傸S酮提取率分別為0.154%、0.152%、0.156%。

2.4.5 工藝正交篩選試驗(yàn) 正交設(shè)計(jì)影響光明護(hù)眼凝膠膏貼劑總黃酮含量的因素主要有提取次數(shù)（A）、加醇量（B）、提取時(shí)間（C）、醇濃度（D），故以這四個(gè)影響因素的3個(gè)水平[4]，采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以散痛風(fēng)凝膠膏貼劑中總黃酮的百分含量為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行考察。各因數(shù)水平選取見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.4.5.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由2.4.3分析，以總黃酮提取率為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。從2.4.4極差可以看出，各因素對(duì)總黃酮類(lèi)提取率影響的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（D）＞回流次數(shù)（A）＞乙醇用量（B）＞提取時(shí)間（D），提取醇濃度80%時(shí)總黃酮百分含量最高，為0.169%。正交結(jié)果分析可見(jiàn)，最佳優(yōu)選工藝為A3B1C2D3，即采用80%醇提取法，在提取3次，加醇量為6倍量，提取時(shí)間1.0 h。見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果

2.4.5.2 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析（表3）

表3 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表

3 討論

通過(guò)醇提法的工藝篩選，優(yōu)選出了光明護(hù)眼凝膠膏貼劑總黃酮的較佳提取工藝80%醇提取，提取3次，加醇量為6倍量，提取時(shí)間1.0 h。篩選出的工藝操作簡(jiǎn)單，省時(shí)節(jié)力，成本較低。采用三乙胺法[5]測(cè)定光明護(hù)眼凝膠膏貼劑中總黃酮百分的含量[6-20]，控制總黃酮提取的最佳條件，為光明護(hù)眼貼凝膠膏貼劑優(yōu)選出最佳提取工藝參數(shù)，合理可靠，簡(jiǎn)單科學(xué)。為光明護(hù)眼貼凝膠膏貼劑提供實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模生產(chǎn)依據(jù)奠定理論基礎(chǔ)。