HPLC法測定枳芩顆粒中黃酮類成分的含量

高紅寧 潘雨柔 殷 奕 毛春芹 陸兔林

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京多康商貿(mào)有限公司，江蘇南京 210000

枳芩顆粒是由枳實(shí)、黃芩、大黃、生姜等六味藥材組成的醫(yī)院制劑，具有清熱瀉火、消積解毒的功效，常用于治療心脾胃脘有積熱，實(shí)邪壅滯腑氣不通所致疼痛、濕熱下利等癥。枳實(shí)為方中君藥，2015年版《中華人民共和國藥典》以測定辛弗林含量來控制枳實(shí)飲片質(zhì)量[1]，國內(nèi)外文獻(xiàn)多以測定其黃酮類成分（柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷）來控制飲片質(zhì)量[2-8]。黃芩為方中臣藥，黃芩苷是其質(zhì)量控制的主要藥效成分，已有報(bào)道對(duì)含黃芩制劑中橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷和新橙皮苷一種或幾種成分進(jìn)行含量測定[9-15]。本試驗(yàn)建立了以高效液相色譜法同時(shí)測定枳芩顆粒中4種黃酮類成分含量的方法，為整體控制枳芩顆粒的質(zhì)量提供可靠、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Agilent公司安捷倫1100 高效液相色譜儀，Chem Station 色譜工作站；昆山市超聲儀器有限公司超聲波清洗器；鞏義市英峪予華儀器廠水浴鍋；德國梅特勒公司AB104-L分析天平。

1.2 試藥

柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201011）；橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201011）；新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111857-201102）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-200514）；以上對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所。枳芩顆粒樣品（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：180112、180118、180123）。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：漢邦Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～ 28 min，5% ～ 26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A）；流速：1 ml/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷對(duì)照品適量，置5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密量取單個(gè)組分對(duì)照品溶液，加甲醇配成每1 ml分別含柚皮苷0.194 mg、橙皮苷0.110 mg、新橙皮苷0.129 mg、黃芩苷0.453 mg的混合對(duì)照品液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取枳芩顆粒適量，研細(xì)，精密稱取1.00 g，置具塞錐形瓶中，加入25 ml甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足損耗的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm的濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液配制 按照枳芩顆粒處方比例分別稱取除枳實(shí)、黃芩以外的其余藥材，按照枳芩顆粒制備方法分別制成缺枳實(shí)、缺黃芩、同時(shí)缺枳實(shí)和黃芩的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法操作，制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀中，色譜圖見圖1。結(jié)果為陰性對(duì)照溶液在指標(biāo)成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的色譜峰位置上無吸收，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷分離良好，在各出峰處均無干擾，表明該方法的專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度和峰面積積分值進(jìn)行線性回歸，求得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 4種對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷峰面積RSD分別為0.34%、0.12%、1.43%、0.98%，表明儀器精密度良好。

圖1 枳芩顆粒的HPLC色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取枳芩顆粒樣品（批號(hào)：180118）1份，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備方法得到供試品溶液，按上述色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷和新橙皮苷的RSD分別為1.21%、1.72%、1.76%、1.98%，表明供試品溶液在24 h范圍內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取枳芩顆粒樣品（批號(hào)：180118）6份，每份1.00 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷平均含量（n= 6）分別為 5.7189、2.8744、3.4124、16.4962 mg/g，RSD 分別為1.50%、1.55%、1.62%、1.25%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的枳芩顆粒樣品（批號(hào)：180118）9份，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液（含柚皮苷2.8614 mg/mL、橙皮苷1.4561 mg/mL、新橙皮苷1.7028 mg/mL和黃芩苷8.2624 mg/mL）0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.89%、96.32%、97.49%和99.13%，RSD分別為1.89%、1.78%、2.20%和2.71%。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取不同批次的枳芩顆粒，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取條件選擇

本試驗(yàn)考察了水、95%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇等不同提取溶劑，結(jié)果以甲醇提取4種成分較完全；在選擇提取方法時(shí)，考察了回流和超聲兩種提取方法，發(fā)現(xiàn)這兩種方法提取效果接近，但超聲提取節(jié)約時(shí)間、操作簡便，故選擇超聲提取法；在選擇提取時(shí)間時(shí)，考察了30、40、50 min不同提取時(shí)間，確定30 min時(shí)4種成分已基本提取完全。

3.2 色譜條件選擇

通過200～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷都在280 nm附近有最大吸收，而黃酮類成分一般都在280 nm處進(jìn)行檢測，故確定280 nm為檢測波長；在選擇流動(dòng)相時(shí)，依次考察了乙腈-水、乙腈-磷酸水、甲醇-水，結(jié)果表明乙腈（A）-0.1%（B）磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，0～28 min，5%～26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A；流速1 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl時(shí)柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷有較好的峰形，各峰間的分離度均大于1.5。故選擇乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相梯度洗脫。

枳芩顆粒具有清熱瀉火、消積解毒的功效，是在臨床上應(yīng)用較廣的醫(yī)院制劑。方中枳實(shí)為君藥，黃芩為臣藥，枳實(shí)中最主要的活性物質(zhì)是橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷，黃芩中含量最高的活性成分是黃芩苷，故選擇君藥枳實(shí)、臣藥黃芩中的主要成分作為枳芩顆粒的定量檢測指標(biāo)。這4種成分均是黃酮類成分，在 280 nm 附近有最大吸收，在同一色譜條件下能很好地分離。本研究同時(shí)測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷可為評(píng)價(jià)枳芩顆粒中活性成分提供一種可靠的分析方法，同時(shí)對(duì)于整體控制枳芩顆粒的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

本研究建立了HPLC法測定枳芩顆粒中黃酮類成分的含量方法，確定以甲醇為提取液，超聲提取30 min ，色譜柱為 Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（梯度洗脫），流速1 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷分別在0.194～3.876、0.110 ～ 2.192、0.129 ～ 2.574、0.453 ～ 9.050 μg/ml時(shí)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率在96.32%～99.89%之間，分離效果好、操作簡便、重現(xiàn)性好、靈敏度高。

表3 枳芩顆粒中4種成分的含量