超聲輔助提取紅豆多糖及其生物活性研究

邵 佩 莊 虎 謝 超 陳 勝

(1. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2. 湖北中煙工業(yè)有限責任公司，湖北 武漢 430040)

紅豆(VignaangularisW.)，屬豆科豇豆屬，又名紅小豆、小豆、赤小豆、赤豆，在中國陜西、江蘇、廣西等地方分布較廣[1]。紅豆藥用價值高，具有良好的健脾止瀉、解毒消腫、預防肝硬化等功效[2]。其食用價值也極高，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物，還含有多酚、多糖、黃酮等多種生物活性成分[3]。

試驗擬以紅豆為原料，采用超聲輔助提取法，以料液比、超聲溫度、超聲時間為考察因素，采用響應面法優(yōu)化提取工藝，經(jīng)脫蛋白、醇沉、透析工藝處理后，評價紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，以期提高紅豆多糖提取率，為紅豆的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與儀器

紅豆：湖北恩施生產(chǎn)；

透析袋：西安優(yōu)博生物科技有限公司；

葡萄糖：標準品，美國Sigma公司;

乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、冰乙酸、三氯化鐵、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀等試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：標準品，上海源葉生物科技有限公司；

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

金黃色葡萄球菌(6538)、大腸桿菌(25922)：美國標準生物品收藏中心；

沙門氏菌、枯草芽孢桿菌：由實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速粉碎機：DFY-300型，溫嶺市林大機械有限公司；

電子分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；

超聲波清洗機：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外—可見分光光度計：UV-1750型，日本島津公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：TX-24LDJ型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；

超凈工作臺：VD-1320型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-250型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 紅豆樣品粉碎打粉后過60目篩，紅豆粉用80%乙醇溶液回流4 h以脫色并除去小分子多糖等，抽濾后將濾渣用無水乙醇、丙酮和乙醚分別清洗，粉末置于室溫下24 h陰干，得紅豆粉末待用[16-17]。

1.2.2 紅豆多糖的提取工藝流程

紅豆粉末→超聲波處理浸提→抽濾除渣→離心(8 000 r/min，10 min)→取上清液→在上清液中加入5%三氯乙酸至提取液不混濁(除蛋白)[18]→離心(8 000 r/min，20 min)→取上清液60 ℃下旋蒸至其體積的1/4左右→加入3倍體積的95%乙醇靜置24～48 h→抽濾→濾渣離心(8 000 r/min，20 min)后取沉淀→用無水乙醇洗滌并收集沉淀→將沉淀溶于蒸餾水透析48 h→冷凍干燥→得紅豆粗多糖

1.2.3 紅豆多糖含量的測定 采用苯酚—硫酸分光光度法[16]。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=5.286x-0.017,R2=0.999 2。

取2 mL稀釋提取液，加入體積分數(shù)5%苯酚溶液1 mL 和濃H2SO45 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，于490 nm處測定吸光度，并使用標準曲線計算紅豆多糖含量[19]。按式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——多糖提取率，%；

V——多糖溶液的體積，mL；

c——葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——紅豆粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 紅豆多糖提取單因素試驗 準確稱取5 g紅豆粉末，用蒸餾水作溶劑，在100 W下進行超聲提取，測定紅豆多糖提取率。

(1) 料液比：固定超聲溫度40 ℃，超聲時間90 min，考察料液比[m紅豆∶V水分別為1∶8，1∶16，1∶24，1∶32，1∶40 (g/mL)]對紅豆多糖提取率的影響。

(2) 超聲溫度：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲時間90 min，考察超聲溫度(20，30，40，50，60 ℃)對紅豆多糖提取率的影響。

(3) 超聲時間：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲溫度40 ℃，考察超聲時間(30，60，90，120，150 min)對紅豆多糖提取率的影響。

1.2.5 響應面法優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上利用響應面法設(shè)計超聲波輔助提取的試驗方法，選取料液比、超聲溫度、超聲時間為影響因素，以紅豆多糖提取率作為試驗設(shè)計的響應值，根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計，利用三因素三水平的試驗設(shè)計優(yōu)化超聲波輔助提取紅豆多糖工藝參數(shù)。

1.2.6 紅豆多糖體外抗氧化活性評價 根據(jù)文獻[20]進行，測定紅豆多糖的總還原能力，以及對·OH和ABTS+·的清除率。

1.2.7 紅豆多糖抑菌活性的測定

(1) 菌種活化：取各待測菌株于TSA培養(yǎng)基上37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，用生理鹽水洗斜面上的菌，充分震蕩使菌懸液的濃度為108CFU/mL，備用[21]。

(2) 抑菌活力的測定：采用文獻[21]中牛津杯法測定紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性。將熔化并冷卻的TSA培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)約15 mL，待凝固后加入100 μL的108CFU/mL菌懸液采用涂布法涂布均勻，在平板標記處放置牛津杯，并于每個牛津杯中吸入200 μL經(jīng)0.22 μm過濾器過濾的10 mg/mL多糖溶液(每組3個平行)。于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑作為抑菌活性的測定指標。

(3) 最低抑菌濃度(MIC)的測定：參照李彥坡等[22]的方法并根據(jù)實際情況有所調(diào)整。將紅豆多糖分別制成0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000 mg/mL 6個濃度梯度，采用涂布法測定，將1 mL不同濃度多糖溶液與25 mL培養(yǎng)基混勻，待培養(yǎng)基凝固后，加入4種供試菌的菌懸液100 μL，涂布均勻后，倒置培養(yǎng)24 h，每組試驗平行測定3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析，Origin 8.0進行繪圖。試驗數(shù)據(jù)均重復3次，以平均值±標準偏差表示，以P<0.05表示差異顯著且具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆多糖的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結(jié)果 由圖1可知，料液比(m紅豆∶V水)選擇1∶16～1∶32 (g/mL)較合適；超聲溫度選擇40～60 ℃較合適；超聲時間選擇60～120 min比較合適。

圖1 3個因素對紅豆多糖提取率的影響

2.1.2 響應面試驗方案設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用軟件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken模式對料液比、超聲溫度、超聲時間進行三因素三水平的響應面試驗設(shè)計(見表1)，試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

2.1.3 回歸模型及方差分析 由表2可知，對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合[23]，得到紅豆多糖提取率對料液比、超聲溫度、超聲時間的二次多項回歸方程：

Y=9.85+0.52A+0.39B+0.19C-0.45AB-0.06AC-0.17BC-0.81A2-1.40B2-0.65C2。

(2)

2.1.4 因素交互作用分析 由圖2可知，料液比和超聲溫度的交互作用極顯著(P<0.01)，料液比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間的交互作用不顯著(P>0.05)，該結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

表1 響應面試驗因素及水平

2.1.5 最佳工藝條件的確定 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26.33 (g/mL)，超聲溫度50.84 ℃，超聲時間93.69 min，此條件下預測的最佳提取率為9.95%。雖然表2中試驗號3和6提取率>10%，但考慮到試驗樣品的隨機性，以及預測值與試驗號3和6提取率值無顯著性差異(P>0.05)，故以Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的最佳提取工藝條件進行驗證實驗?？紤]到實際情況，將工藝條件適當調(diào)整為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時間94 min，在該條件下進行3次平行試驗，紅豆多糖提取率平均值為(9.92±0.04)%，與預測最佳提取率基本一致，說明該模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

表2 紅豆多糖響應面試驗方案及結(jié)果

表3 回歸方程各項的方差分析?

2.2 紅豆多糖的抗氧化活性

2.2.1 總還原能力 由圖3可知，紅豆多糖的總還原能力與多糖濃度之間均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當多糖質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時，隨著濃度升高，多糖的總還原能力顯著增加，與李粉玲等[13]的結(jié)論一致。當紅豆多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，總還原能力最強，吸光值達(0.486±0.007)。表明紅豆多糖有較好的抗氧化能力，但顯著弱于維生素C的抗氧化能力(P<0.05)。

圖2 響應面及等高線圖

圖3 紅豆多糖總還原能力

2.2.2 清除·OH能力 由圖4可知，當多糖質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時，隨著濃度升高多糖對·OH清除率逐漸增大。當質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，多糖對·OH清除率達(90.25±1.38)%，顯著低于同濃度下維生素C對·OH清除率(P<0.05)。試驗結(jié)果顯著高于李粉玲等[13]研究的紅豆多糖和鐘葵等[26]研究的綠豆多糖在同質(zhì)量濃度下的·OH清除率，表明紅豆多糖對·OH有較強的清除能力。

2.2.3 清除ABTS+·能力 由圖5可知，當多糖質(zhì)量濃度低于1.5 mg/mL時，多糖對ABTS+·清除能力存在量效關(guān)系，隨著濃度升高，多糖對ABTS+·清除能力增大；當多糖質(zhì)量濃度為1.5～2.0 mg/mL時，對ABTS+·清除率的增長趨緩。當多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，紅豆多糖對ABTS+·清除能力達到最大值(96.20±3.25)%，與維生素C的ABTS+·清除能力無顯著性差異(P>0.05)。許海燕等[27]研究顯示樺菌芝多糖在2.0 mg/mL時對ABTS+·清除率為90%，低于試驗結(jié)果，表明一定質(zhì)量濃度下紅豆多糖對ABTS+·有較強的清除能力。

2.3 紅豆多糖的抑菌活性

2.3.1 抑菌圈直徑 由表4可知，紅豆多糖對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌具有不同程度的抑制作用，其中，紅豆多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌直徑為(9.54±0.22) mm，與許海燕等[27]樺菌芝多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑接近；對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑制較弱，抑菌圈直徑分別為(8.24±0.06)，(8.19±0.17) mm。紅豆多糖對4種供試菌的抑制作用強弱順序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>沙門氏菌>枯草芽孢桿菌，表明紅豆多糖具有良好的抑菌效果。

圖4 紅豆多糖對·OH清除率的影響

圖5 紅豆多糖對ABTS+·清除率的影響

2.3.2 最小抑菌濃度 由表5可知，紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的MIC值分別為2.500，5.000，10.000，10.000 mg/mL，說明紅豆多糖金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性最弱。結(jié)果表明紅豆多糖的抑菌活性隨著濃度增大而增強，且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌。

表4 紅豆多糖對4種供試菌的抑菌圈直徑?

表5 紅豆多糖對4種供試菌的MIC?

3 結(jié)論

通過單因素和響應面試驗確定了紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時間94 min，此條件下多糖提取率為(9.92±0.04)%。對紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性結(jié)果顯示：① 紅豆多糖具有較強的總抗氧化活性，但總還原能力及對羥基自由基、ABTS+自由基清除能力均低于維生素C；② 紅豆多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，且對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強。此外，目前關(guān)于紅豆多糖的相關(guān)報道較少，后期研究可以從以下方面入手：① 試驗初探了紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，后面可對紅豆多糖抗氧化活性成分構(gòu)效關(guān)系及抑菌機理展開研究；② 試驗提取的紅豆多糖為粗多糖，純度為62%，后續(xù)可對紅豆多糖進一步分離純化，提高多糖純度。