高效液相色譜法測定嬰幼兒營養(yǎng)米粉中維生素A、D3和E含量的不確定度評定

張榮彬 戴志勇 李夢怡 陳振桂 任國譜

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 英氏控股集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410005)

維生素A和D是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嬰幼兒營養(yǎng)米粉中必須添加的維生素，維生素E是可選擇添加的維生素。維生素A、D和E分別履行不同的職能，適當(dāng)?shù)奶砑泳S生素有助于嬰幼兒的生長發(fā)育[1]。維生素A對多種眼科疾病治療具有積極的作用，可促進(jìn)眼內(nèi)色素形成，防止夜盲和視力惡化[2]，對機(jī)體的生理具有調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)身體成長發(fā)育、保持代謝平衡和增強(qiáng)免疫力[3]。維生素D對部分礦物質(zhì)元素吸收具有促進(jìn)作用，并保持體內(nèi)鈣、磷含量足夠。同時，在內(nèi)分泌系統(tǒng)中，維生素D還參與機(jī)體調(diào)節(jié)和無機(jī)鹽交換[4]。維生素E俗稱生物酚，對生殖器官的正常功能具有維持作用[5]，可降低衰老速度，增強(qiáng)機(jī)體耐力，保護(hù)細(xì)胞組織和預(yù)防疾病。而過量攝入維生素A、D和E也會產(chǎn)生副作用，因此監(jiān)測和控制維生素含量十分重要。

測量不確定度是表征合理的賦予被測量之值的分散性，是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[6]，不確定度評估在實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比對、方法確認(rèn)、標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備校準(zhǔn)和數(shù)值溯源等方面具有很重要的意義，并且國際上與合格評定相關(guān)各方對測量不確定度也十分重視[7-8]。在脂溶性維生素檢測方法中，最常用的為光譜法[9]、色譜法[10-11]、化學(xué)法和微生物法等，但其存在種種缺點(diǎn)，樣品處理復(fù)雜、檢測時間長、效率低，且不能同時檢測和分析多種維生素，隨著檢測方法的不斷發(fā)展，高效液相色譜法，提高了分析速度與靈敏度，且可以同時進(jìn)行多種維生素檢測。參照GB 5009.82—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測定》、JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)，對高效液相色譜法測定幼兒營養(yǎng)米粉中維生素A、D3和E含量不確定度進(jìn)行分析和評定，旨在提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并為嬰幼兒營養(yǎng)米粉的產(chǎn)品質(zhì)量控制及檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嬰幼兒營養(yǎng)米粉：湖南英氏營養(yǎng)品股份有限公司檢驗(yàn)研發(fā)中心質(zhì)控樣品。

1.2 試劑

抗壞血酸、BHT、無水乙醇、石油醚、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀：分析純，廣西西隴科學(xué)股份有限公司；

維生素A、D3和E標(biāo)準(zhǔn)品：濃度>98%，上海安普實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器)：LC-20AT型，日本島津公司；

避光恒溫水域振蕩器：SHA-B型，常州博納瑞儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 稱取5.000 g樣品于150 mL錐形瓶，加入30 mL溫水和1 g淀粉酶，60 ℃恒溫水浴振蕩30 min 后加1.0 g抗壞血酸、0.1 g BHT、30 mL無水乙醇、15 mL氫氧化鉀溶液，80 ℃回流皂化30 min后冷至室溫，皂化液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗后加50 mL石油醚萃取5 min，將水相轉(zhuǎn)移至另一250 mL分液漏斗，按上述步驟萃取第2次后合并醚層，水洗至中性。醚層經(jīng)無水硫酸鈉濾入250 mL蒸發(fā)瓶，15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次后一同并入，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴中減壓蒸餾至近干后再氮吹至干，用甲醇定容至10 mL容量瓶，0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾檢測維生素A、E。

取5 mL上述溶液于10 mL容量瓶中水浴氮吹至干后加1 mL正己烷，0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后進(jìn)行半制備，凈化待測液。將待測液注入液相色譜儀，根據(jù)維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間收集維生素D3餾分于2 mL容量瓶，水浴氮?dú)獯蹈珊蠹?.0 mL甲醇溶解，即維生素D3待測液。

1.4.2 維生素A、D3、E標(biāo)準(zhǔn)液配制

(1) 維生素A、D3和E標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：準(zhǔn)確稱取25.0，2.4，65.9 mg的維生素A、D3和E(α-生育酚)標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇溶解；維生素A和E用50 mL級容量瓶定容，質(zhì)量濃度為0.500，0.024 mg/mL；維生素D3用100 mL 容量瓶定容，質(zhì)量濃度為1.318 mg/mL。

(2) 維生素A、D3中間液：分別吸取維生素A和D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mL與1 mL，分別在10 mL和100 mL容量瓶中用水定容，中間液質(zhì)量濃度為100 μg/mL和0.24 μg/mL。

(3) 維生素A、D3、E 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：吸取維生素A中間液和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲備液100，200，400，600，800 μL，取10 mL容量瓶加水定容，維生素A工作液質(zhì)量濃度1，2，4，6，8 μg/mL，維生素E質(zhì)量濃度13.18，26.36，52.72，79.08，105.44 μg/mL。

吸取維生素D3中間液100，200，400，600，800 μL，取10 mL容量瓶加水定容，得到質(zhì)量濃度為0.024，0.048，0.096，0.144，0.192 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.4.3 色譜條件 高效液相色譜法測定嬰幼兒營養(yǎng)米粉中維生素A、D3和E的色譜條件見表1。

2 模型建立

2.1 數(shù)學(xué)模型

要計(jì)算不確定性，必須首先完善用于計(jì)算測量值的數(shù)學(xué)模型，以便分析其可能的不確定性來源[12]。只有考慮到影響測量值不確定度的主要因素時，整個計(jì)算過程中才能接受所得到的各自的相對不確定度值[13]，因此此次試驗(yàn)的維生素A、D3和E模型分別為：

(1)

(2)

(3)

表1 色譜條件

式中：

X——維生素的含量，μg/100 g；

C——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的維生素濃度，μg/mL；

f——維生素D3濃縮液體積，mL；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

R——回收率因子。

2.2 不確定度主要來源

參照試驗(yàn)方法并結(jié)合試驗(yàn)操作，不確定的來源主要有：① 樣品制備過程引入的不確定度UrelYP；② 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度UrelBZ；③ 重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度UrelCF；④ 回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelHS。

3 不確定度分量的評定

3.1 樣品制備過程引入的不確定度UrelYP

3.1.1 樣品取樣引入的不確定度Urelm1依據(jù)GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化部分 總則》，樣品混勻后隨機(jī)取樣，均勻且具有代表性，忽略其不確定度。

取樣量為5.000 g時引入的相對不確定度為：

3.1.3 樣品定容引入的不確定度UrelD試樣經(jīng)過處理進(jìn)行定容，維生素A與E樣品定容均采用10 mL容量瓶，維生素D3樣品在10 mL容量瓶初步處理后進(jìn)行半制備，半制備過程中使用1 mL和5 mL移液管，并最終定容在2 mL容量瓶中，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2，樣品定容引入的不確定度為：

UrelD-維生素A=UrelD-維生素E=0.001 31。

3.1.4 樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

(4)

綜上所述，由式(4)求得：UrelYP-維生素A=0.001 31，UrelYP-維生素D3=0.006 38，UrelYP-維生素E=0.001 31。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度UrelBZ

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液引入的相對不確定度UrelC

(1) 標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度UrelC1：通過標(biāo)準(zhǔn)證書可知，維生素A、D3、E不確定度分別為1%，1%，2%，均勻分布，K=2，則標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度為：

UrelC1-維生素A=UrelC1-維生素D3=0.005 00；

UrelC1-維生素E=0.010 00。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelC2：稱取維生素A、D3和E標(biāo)準(zhǔn)品，分別為25.0，2.4，65.9 mg，根據(jù)3.1.2得知，電子天平US為0.000 057 7 g，根據(jù)式(5)求得其相對不確定度分別為：UrelC2-維生素A=0.002 31，UrelC2-維生素D3=0.024 16，UrelC2-維生素E=0.000 88。

(5)

式中：

US——電子天平標(biāo)準(zhǔn)不確定度，g；

m——稱取的維生素A、D3和E標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量，mg。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelC3：維生素A與E標(biāo)準(zhǔn)品均采用50 mL容量瓶，維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品需用100 mL容量瓶。樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

(6)

根據(jù)表3數(shù)據(jù)并結(jié)合式(6)，則標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

UrelC3-維生素A=UrelC3-維生素E=0.000 832；

UrelC3-維生素D3=0.000 833。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

(7)

由式(7)求得：

UrelC-維生素A=0.005 70；

UrelC-維生素D3=0.024 69；

UrelC-維生素E=0.010 07。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelX

標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行稀釋時，維生素A、D3分別用2 mL 和1 mL移液管，且都需10 mL容量瓶進(jìn)行定容。根據(jù)表4，其稀釋引入的不確定度為：

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelG根據(jù)表5數(shù)據(jù)，計(jì)算結(jié)果為：

表2 樣品定容引入的不確定度?

表3 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度?

表4 稀釋引入的不確定度?

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液制備引入的不確定度?

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelQ分別配制1，2，4，6，8 μg/mL的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.024，0.048，0.096，0.144，0.192 μg/mL的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，13.18，26.36，52.72，79.08，105.44 μg/mL的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，每濃度測量兩次，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與峰面積曲線，數(shù)據(jù)見表6。

Sy為回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)偏差公式：

(8)

不確定度的計(jì)算公式：

(9)

表6 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(10)

式中：

Ai——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率；

B——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線截距；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作液的測試次數(shù)，n=10；

yi——不同濃度對應(yīng)的峰的峰面積；

P——測試次數(shù)，P=2；

根據(jù)表6，標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：UrelQ-維生素A=0.010 76，UrelQ-維生素D3=0.014 93，UrelQ-維生素E=0.004 24。

綜上所述，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度為：

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度UrelCF

稱取同一批次的嬰幼兒米粉，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，同時進(jìn)行前處理，在相同的高效液相色譜條件下平行測定定容后試樣液中維生素A、D3和E的濃度，呈正態(tài)分布，采用極差法，結(jié)果見表7。

單次試驗(yàn)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差公式為：

(11)

兩次測定嬰幼兒營養(yǎng)米中維生素A、D3、E含量的平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

(12)

根據(jù)表7計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度為：UrelCF-維生素A=0.003 84，UrelCF-維生素D3=0.021 70，UrelCF-維生素E=0.005 15。

3.4 回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度UrelHS

準(zhǔn)確稱取約5.000 g嬰幼兒營養(yǎng)米粉固體，加入維生素A、D3和E各3個濃度梯度進(jìn)行回收率的測定。但由于試樣酶解不完全、皂化不完全，石油醚萃取和蒸餾濃縮操作不當(dāng)、基質(zhì)的干擾等，導(dǎo)致維生素A、D3和E的損失，則嬰幼兒米粉中維生素A、D3和E不能100%的進(jìn)入測定中。本底樣品6次數(shù)據(jù)見表8。

表7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果

表8 本底樣品6次數(shù)據(jù)

表9 維生素A加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

表10 維生素D3加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

表11 維生素E加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

則：UrelHS-維生素A=0.009 90;UrelHS-維生素A=0.012 70;UrelHS-維生素E=0.007 47。

為了判斷是否引進(jìn)回收率校正因子R，在實(shí)際計(jì)算時，需要對回收率進(jìn)行顯著性分析[15]。

將數(shù)據(jù)代入式(13)，則T維生素A=6.891 9；T維生素D3=9.552 9；T維生素E=5.791 9，根據(jù)t檢驗(yàn)臨界值分布表，當(dāng)自由度f=4時，查t臨界值分布表[16]，t(0.05，4)=2.776 0。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，T維生素D3>T維生素A>T維生素E>2.776，因此計(jì)算需要引入校正因子。

(13)

3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式如式(14)所示。

(14)

根據(jù)式(14)且結(jié)合數(shù)據(jù)，合成標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果如表12所示。

3.6 擴(kuò)展不確定度

在置信概率95%時，K=2，則擴(kuò)展不確定度為：

表12 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.7 測量不確定度報(bào)告

高效液相色譜儀同時對嬰幼兒營養(yǎng)米粉中維生素A、D3和E含量進(jìn)行測定，結(jié)果為：

X維生素A=(9.250 0±0.188 4) μg/g(K=2)；

X維生素D3=(0.114 0±0.009 3) μg/g(K=2)；

X維生素E=(0.1815±0.006 7) μg/g(K=2)。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜法同時對嬰幼兒營養(yǎng)米粉中維生素A、D3和E進(jìn)行測定，當(dāng)取樣量為5.000 g時，樣品中維生素A、D3和E擴(kuò)展不確定度為0.188 4，0.009 3，0.006 7 μg/g，測定含量為(9.250 0±0.188 4)，(0.114 0±0.009 3)，(0.181 5±0.006 7) μg/g。

結(jié)合試驗(yàn)過程及計(jì)算結(jié)果可知，嬰幼兒米粉中維生素A、D3和E的最終結(jié)果的不確定度主要是由標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合和回收率引起的。因此，選擇最佳試驗(yàn)條件、采用高精密度儀器、定期維護(hù)及保養(yǎng)設(shè)備、改善試驗(yàn)方法和規(guī)范試驗(yàn)操作對提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。