液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒護(hù)膚品中28 種抗組胺藥物

虞雪軍，楊婷婷，吳珍，占翌領(lǐng)，易路遙

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

化妝品中基質(zhì)復(fù)雜、輔料較多，又與人體皮膚直接接觸，常引起皮膚疾病，皮膚過敏是其中極常見的一種。為避免皮膚過敏反應(yīng)的發(fā)生，不法廠商可能會(huì)添加一些抗過敏藥物?？菇M胺類藥物是皮膚科常用的抗過敏藥，應(yīng)用于濕疹、藥疹、接觸性皮炎及皮膚瘙癢癥等發(fā)癢性皮膚病［1］。長(zhǎng)期使用含有抗組胺藥物的化妝品會(huì)導(dǎo)致藥物依賴性皮炎，停用后，過敏癥狀就會(huì)加重，造成毛細(xì)血管擴(kuò)張、萎縮，出現(xiàn)皮膚變薄、色素沉著、皮炎等癥狀。同時(shí)，還可能引起人體內(nèi)激素水平變化，造成內(nèi)分泌混亂，引起內(nèi)分泌疾病［2-4］。

目前，化妝品中抗組胺類物質(zhì)常用的分析測(cè)定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［5］、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）［6］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［7］、超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）［8-9］。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）“2.18 地氯雷他定等15 種組分”［10］和《化妝品中多西拉敏等9 種抗過敏藥物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T32986-2016）兩個(gè)檢驗(yàn)方法總共可測(cè)定20 種抗組胺藥物，文獻(xiàn)報(bào)道中最多同時(shí)測(cè)定21 種抗組胺物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)2010 年至2020 年期間全國(guó)1 429 個(gè)不合格項(xiàng)目中，檢出46 批次含有抗組胺藥物樣品，占比為3.22%，抗組胺藥物主要為非法添加，已檢測(cè)到添加成分有氯苯那敏、苯海拉明、賽庚啶等［11］。而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗組胺藥物不斷在更新，因此有必要增加篩選組分，擴(kuò)大篩查范圍，完善檢驗(yàn)方法。

本研究在整合現(xiàn)有檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、已有研究基礎(chǔ)，增加抗組胺藥物種類，形成一套涵蓋28 種抗組胺成分的LC-MS/MS 方法。該方法簡(jiǎn)單快捷易操作，可行性強(qiáng)，為后期開展相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)監(jiān)測(cè)提供科學(xué)的依據(jù)，為全面監(jiān)管積累更多的科學(xué)數(shù)據(jù)及技術(shù)支撐方法，以期能更好地保障化妝品使用安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Xevo 7Q-S 液相串聯(lián)質(zhì)譜儀、VORTEX WX 渦旋混合器、ST16R 離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher）、超聲波清洗器、XS205DU 電子天平、ML204 電子天平。

28 種抗過敏標(biāo)準(zhǔn)品馬來酸氯苯那敏、阿司咪唑、地氯雷他定、鹽酸曲吡那敏、鹽酸羥嗪、奮乃靜、鹽酸氟奮乃靜、鹽酸氯丙嗪、氯雷他定、特非那定、鹽酸賽庚啶、琥珀酸多西拉敏、鹽酸美沙吡林、鹽酸賽克利嗪、馬來酸溴苯那敏、鹽酸二苯拉林、鹽酸氯苯沙明、鹽酸苯海拉明、鹽酸去氯羥嗪、非索非那定、鹽酸異丙嗪、依巴斯汀、左卡巴斯汀鹽酸鹽、鹽酸西替利嗪、阿伐斯汀、富馬酸依美斯汀、鹽酸氮斯汀、咪唑斯汀，純度均大于98%。甲醇為色譜純；甲酸銨為色譜純；水為二次蒸餾水。68 批次嬰幼兒護(hù)膚類化妝品均來自流通環(huán)節(jié)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取28 種標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定，分別置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀釋后，定容至刻度，搖勻作為單標(biāo)儲(chǔ)備液；吸取單標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為100 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用甲醇配制成濃度為1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 和15.0 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，于4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

稱取0.20 g 樣品于50 mL 具塞比色管中，加入甲醇40 mL，渦旋振蕩30 s，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，用甲醇定容至50 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min。取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.15 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A（甲醇），B（20.0 mmol/L 甲酸銨溶液）；梯度洗脫程序：0～1.0 min，55% B；1.0～4.0 min，55% B～20% B；4.0～7.0 min，20% B；7.0～7.1 min，20% B～55% B；7.1～11.0 min，55% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI 源；掃描方式：正離子模式掃描；掃描范圍：100～1 000 m/z；離子源溫度：450 ℃；噴霧電壓：3 000 V；干燥氣流速：800 L/h；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流速：150 L/h；碰撞氣流速：0.15 mL/min；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 28種抗過敏藥物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）“2.18 地氯雷他定等15 種組分”和《化妝品中多西拉敏等9 種抗過敏藥物的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T32986-2016），對(duì)比0、5、10、20 mmol/L 甲酸銨溶液，確定流動(dòng)相為甲醇和20.0 mmol/L 甲酸銨溶液，28 種組分有較好的峰形及響應(yīng)。為提高分析效率，選用ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）填料粒度較小的色譜柱，在被測(cè)物有較好的分離效果的前提下，控制方法分析時(shí)間為11 min，縮短檢測(cè)時(shí)間。

2.2 特異性

照上述方法測(cè)定陰性樣品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液（10 μg/L），記錄總離子流圖，見圖1。

圖1 陰性樣品溶液（A）、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（B）和混合加標(biāo)溶液（C）的總離子流圖

陰性樣品溶液的圖譜中基本無雜峰，表明該方法的干擾較少，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的圖譜基本一致，特異性較好；28 種目標(biāo)化合物色譜分離較好，峰形尖銳對(duì)稱，11 min 內(nèi)全部出峰，滿足試驗(yàn)分析要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取“1.2”項(xiàng)下系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制28 種組分標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，線性范圍為1～15 μg/L 時(shí)，各目標(biāo)化合物均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.994 3～ 0.999 6。在基質(zhì)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以目標(biāo)化合物的3 倍信噪比確定方法檢出限，28 種組分檢出限結(jié)果為15～54 μg/kg，以目標(biāo)化合物的10倍信噪比確定方法定量限，28 種組分定量限結(jié)果為60～180 μg/kg。

表2 28種組分標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

2.4 方法的回收率和精密度

以水劑、乳劑、霜?jiǎng)╆幮詷悠纷龌厥章试囼?yàn)，分別添加3 個(gè)不同濃度水平（分別為250、500 和1 250 μg/kg），設(shè)置6 份平行。照上述試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理，上機(jī)，記錄結(jié)果，得到3 種基質(zhì)的回收率。3 種基質(zhì)結(jié)果顯示，28 種組分平均回收率在75.2%～125.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～10.0%。方法準(zhǔn)確度及精密度良好，能滿足痕量測(cè)定的要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以水劑、乳劑、霜?jiǎng)╆幮詷悠?，分別添加3 個(gè)不同濃度水平（分別為250、500 和1 250 μg/kg），于0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄各組分測(cè)定值，計(jì)算各組分3 個(gè)添加水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示28 種抗組胺類藥物測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品測(cè)定

采用本方法測(cè)定了68 批次流通環(huán)節(jié)嬰幼兒護(hù)膚類化妝品，均未檢出28 種抗組膠藥物，仍需持續(xù)擴(kuò)充抗組胺類藥物的篩查成分及測(cè)定樣品的數(shù)量。

3 討論

由于嬰幼兒皮膚比較嬌嫩，抗摩擦力和抗病力差，易受刺激；皮膚角層較薄，防止有害物質(zhì)入侵的能力弱［12］；嬰幼兒堿性皮膚更容易受到細(xì)菌感染，加之皮膚結(jié)構(gòu)不完整，角質(zhì)層和皮脂膜發(fā)育不成熟，對(duì)接觸到皮膚外來物質(zhì)吸收較快，抵抗能力較差，很容易引起皮膚過敏反應(yīng)，不法商家可能針對(duì)上述原因，非法添加抗組胺類物質(zhì)。因此有必要對(duì)嬰幼兒護(hù)膚品中非法添加抗組胺藥物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

本研究采用直接提取法，快速、簡(jiǎn)單、可靠，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，線性關(guān)系、回收率、精密度及重復(fù)性均良好，目標(biāo)物干擾少，適用于嬰幼兒護(hù)膚品中28 種抗組胺類藥物的快速檢測(cè)分析。