紫花前胡的提取工藝優(yōu)化研究

馬思楠， 李 欠*，陳玉瑩，馮彥梅，余 萍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070； 3.甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070)

中藥紫花前胡是傘形科當(dāng)歸屬植物紫花前胡Peucedanumdecursivum(Miq.) Maxim 的干燥根[1]。紫花前胡為常用中藥，具有降氣化痰，疏散風(fēng)熱的功效，用于治療風(fēng)熱咳嗽痰多等癥[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紫花前胡中主要活性成分是香豆素類(lèi)化合物，其具有抗神經(jīng)衰弱、抗凝血、抗氧化、抗菌、抗癌等多方面的藥理活性[3-4]，在藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

中藥成分復(fù)雜，采用單一指標(biāo)成分來(lái)控制單味藥材的質(zhì)量，具有一定的片面和局限性[5]。因此多指標(biāo)定量分析受到人們廣泛的關(guān)注,而中藥多指標(biāo)分析的前提是中藥多組分的提取，所以?xún)?yōu)選適合中藥多指標(biāo)成分的提取工藝參數(shù)是關(guān)鍵所在。近年來(lái)，響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于優(yōu)化中藥提取工藝的研究[6-9]，具有試驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較少、檢測(cè)精確度高、預(yù)測(cè)的函數(shù)模型精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)[10-11]。目前對(duì)紫花前胡藥材研究多集中在單指標(biāo)成分含量測(cè)定，多指標(biāo)成分含量研究較少[12]。為此，以紫花前胡為研究對(duì)象，以香豆素類(lèi)成分紫花前胡苷、傘形花內(nèi)酯、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)合響應(yīng)面法，優(yōu)化紫花前胡的提取工藝，對(duì)進(jìn)一步提升紫花前胡資源的開(kāi)發(fā)和利用具有重大意義。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

Waters 高效液相色譜儀(上海市沃特世科技有限公司)；KQ-500B超聲波清洗儀(深圳市得康科技有限公司)；JFSD-100粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠)；AL-104電子分析天平(慈溪市天東衡器廠)；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

對(duì)照品傘形花內(nèi)酯(批號(hào)18010202)、紫花前胡苷(批號(hào)18030702)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào)19101703)、花椒毒素(批號(hào)17111503)、佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)17120501)均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%；乙腈、甲醇(色譜純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；紫花前胡藥材采購(gòu)于甘肅黃河藥材市場(chǎng)經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)教研室陳垣教授鑒定為中藥紫花前胡。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別置于5 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解并稀釋即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為42、41、41、86、56 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，用時(shí)加甲醇溶液稀釋?zhuān)玫胶胁煌|(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取紫花前胡藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)1 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加甲醇25 mL，浸漬1 h后超聲(功率250 W、頻率50 KHz)提取20 min，取出，冷卻補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。進(jìn)樣前用0.45 μL微孔濾膜濾過(guò)。

2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，20%～25% B；2～18 min，25%～40%B；18～28 min，40%～50%B；28～31 min，50%～65%B；31～45 min，20%B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm，325 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。在上述條件下傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯的分離度良好，混合對(duì)照品及紫花前胡樣品HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A),(B)和紫花前胡樣品(C),(D)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed references(A),(B)and sample (C),(D) 注：1-傘形花內(nèi)酯；2-紫花前胡苷；3-補(bǔ)骨脂素；4-花椒毒素；5-佛手柑內(nèi)酯

2.3 高效液相色譜法方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

將上述不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品按照“2.2”項(xiàng)依次進(jìn)樣，測(cè)定并記錄各色譜峰峰面積。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算5種香豆素類(lèi)物質(zhì)的Relative standard deviation(RSD)值。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取紫花前胡樣品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算5種香豆素類(lèi)物質(zhì)的RSD值。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份供試品溶液，在同一試驗(yàn)條件下測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算5種香豆素類(lèi)物質(zhì)的RSD值。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的紫花前胡樣品1 g，平行6份，分別加入一定量的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率。

2.4 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)量單因素及響應(yīng)曲面試驗(yàn)樣品，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備溶液，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行制備3份，得到樣品含量平均值。

2.5 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理[9,13-14]，得到5種指標(biāo)成分的綜合評(píng)分。

2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以5種香豆素類(lèi)成分含量的綜合評(píng)分值為考察指標(biāo)，分別考察液料比、甲醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)條件Table 1 Design of single factor tests

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

以上述優(yōu)化后的各單因素值為基礎(chǔ)，通過(guò)Design-Expert 8.0.6 Trial軟件Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對(duì)液料比、甲醇濃度、超聲時(shí)間3個(gè)因素結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化，重復(fù)試驗(yàn)，并進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 線性關(guān)系考察

分別以對(duì)照品的峰面積(X)與對(duì)照品溶液濃度(Y)做線性回歸，得到傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯的回歸方程及線性范圍分別為：

Y=19285X+6074.9，R2=0.999 8，線性范圍0.07～42.00 μg·mL-1；

Y=38779X+10295，R2=0.999 8，線性范圍0.06～41.00 μg·mL-1；

Y=25689X+6779.5，R2=0.999 8，線性范圍0.07～41.00 μg·mL-1L；

Y=41421X+28717，R2=0.999 8，線性范圍0.14～86.00 μg·mL-1；

Y=24865X-559.34，R2=0.999 9，線性范圍0.09～56.00 μg·mL-1。

3.1.2 精密度試驗(yàn)

以峰面積計(jì)算得到傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯的RSD分別為0.96%、0.62%、1.08%、0.86%、0.84%，表明該條件下儀器的精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以峰面積計(jì)算得到傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯的RSD分別為0.82%、0.15%、0.86%、0.45%、0.86%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

以峰面積計(jì)算得到傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯的RSD分別為0.28%、0.61%、1.56%、0.45%、0.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

傘形花內(nèi)酯，紫花前胡苷，補(bǔ)骨脂素，花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯平均回收率分別為101.31%、105.27%、90.85%、106.42%、90.19% ，RSD分別為2.07%、3.17%、1.62%、2.53%、4.54%，結(jié)果顯示加樣回收率良好。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察結(jié)果采用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)(表2)。當(dāng)液料比增加時(shí)，有利于有效成分?jǐn)U散，從而增大提取極限[15]。隨著液料比增加，有效成分獲得足夠的擴(kuò)散空間，提取率達(dá)到最佳且基本穩(wěn)定?？紤]到液料比會(huì)對(duì)溶液的酸堿度產(chǎn)生影響，使紫花前胡中某些香豆素苷類(lèi)成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此液料比35 mL·g-1作為最優(yōu)選擇。

3.2.2 甲醇濃度對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)進(jìn)行，考察結(jié)果采用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)(表2)。隨著甲醇濃度的增加，有利于有效成分脫離固體表面溶解到溶劑主體中，增大溶出率[16]，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到80%時(shí)，五種香豆素類(lèi)成分總的提取率達(dá)到最高，甲醇濃度高于80%，提取率緩慢降低。由于甲醇是中性溶劑且藥材成分復(fù)雜，對(duì)于有效成分的溶解有一定的限制，若甲醇和水按照一定比例溶解，會(huì)加速藥材中親脂和親水性成分的溶出，所以選擇甲醇濃度80%為最佳提取濃度。

3.2.3 超聲時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察結(jié)果采用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)(表2)。利用超聲提取的機(jī)械作用、空化作用和熱效應(yīng)，增大溶劑的擴(kuò)散、浸透和溶解[16]，當(dāng)超聲時(shí)間在20～40 min時(shí)，綜合評(píng)分逐漸增大，在40～50 min時(shí)，綜合評(píng)分緩慢減小。推測(cè)出有效成分隨著超聲時(shí)間的增加，紫花前胡中有效成分逐漸溶出，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定時(shí)間后，提取時(shí)間的增加會(huì)破壞有效成分的析出，因此，選擇40 min作為最佳超聲時(shí)間。

表2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of single factor tests

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)零點(diǎn))的三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以料液比(A)、甲醇濃度(B)、超聲時(shí)間(C)為自變量，5種香豆素類(lèi)成分含量的綜合評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)。

3.3.2 模型顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行擬合，得二次多元回歸方程：

R=7.72+1.66A+0.36 B+1.32 C+0.17 AB+0.94AC-0.17BC-7.59A2-5.07 B2-2.16 C2

由表4的方差分析結(jié)果可知，該擬合模型具有極顯著(P<0.001)失擬項(xiàng)不顯著(P=0.2605)。由F值可以看出，所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)成分提取的影響大小為液料比(A)>超聲時(shí)間(C)>甲醇濃度(B)。

3.3.3 最佳提取工藝優(yōu)化與參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果

以5種香豆素類(lèi)成分含量最大值為目標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件繪制三維響應(yīng)面圖(圖2)并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。以各組分綜合評(píng)分值為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選紫花前胡最佳提取工藝參數(shù)為液料比33.69 mL·g-1，甲醇濃度80.32%，超聲時(shí)間46.64 min。在此條件下，5種香豆素類(lèi)成分提取綜合評(píng)分為5.940 1。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken test

表4 回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for regression model

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的可行性，將工藝參數(shù)調(diào)整為，液料比34 mL·g-1，甲醇濃度80%，超聲時(shí)間47 min，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)結(jié)果的均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，得綜合評(píng)分為6.073 4，與預(yù)測(cè)值5.940 1相比，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值偏差為2.28%，模型預(yù)測(cè)性好，說(shuō)明優(yōu)化后的提取工藝可靠，穩(wěn)定，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。將《中國(guó)藥典》2015年版中所使用的含量測(cè)定方法制備供試品溶液，與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)藥典中規(guī)定的紫花前胡苷含量為單一評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化的提取工藝比藥典法高；傘形花內(nèi)酯含量也明顯高于藥典法，而其它3種香豆素類(lèi)成分含量無(wú)明顯變化。因此，基于多指標(biāo)綜合評(píng)分法建立的提取工藝參數(shù)，其重復(fù)性好，操作性強(qiáng)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖2 紫花前胡提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面圖Fig.2 Optimized response surface map of extraction process of P. decursivum

表5 工藝驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

中藥紫花前胡的研究主要集中在化學(xué)成分分離分析和單一成分的藥理作用，對(duì)于多指標(biāo)成分含量研究還相對(duì)較少。香豆素類(lèi)是紫花前胡中含量相對(duì)較多且生物活性較強(qiáng)的一類(lèi)化合物[17-19]，具有多種藥理活性，是廣泛分布于植物界中的次生代謝產(chǎn)物[3]。因此，研究紫花前胡中香豆素類(lèi)化合物具有重大意義。

目前藥典中紫花前胡藥材質(zhì)量控制僅以紫花前胡苷單指標(biāo)性成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]，而中藥成分復(fù)雜，單一成分難以綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，無(wú)法保證中藥臨床藥效。因此，為了更好的發(fā)揮其藥用價(jià)值，對(duì)其化學(xué)成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取工藝主要以提取含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而高效液相色譜法測(cè)定藥材成分的含量會(huì)更加準(zhǔn)確和可靠，故本實(shí)驗(yàn)選擇HPLC法檢測(cè)5種香豆素類(lèi)成分即傘形花內(nèi)酯、紫花前胡苷、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯的含量，以這5種香豆素類(lèi)成分的總提取量為指標(biāo)進(jìn)行單因素考察，通過(guò)單因素試驗(yàn)選擇合適的3因素3水平，以料液比、甲醇濃度和超聲時(shí)間進(jìn)行考察，為避免5種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異太大造成低含量成分的影響被掩蓋的問(wèn)題而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將5種香豆素類(lèi)成分的含量用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理得到綜合評(píng)分作為響應(yīng)值，再通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行擬合，得到最佳的提取工藝條件，為進(jìn)一步研究紫花前胡有效成分開(kāi)發(fā)利用提供參考價(jià)值。