從膠原代謝環(huán)節(jié)探討補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者盆底結締組織的影響

王之通 ，蔣 健 ，吳 雨，陳文文，沈明潔，錢 麟，胡 慧，譚 麗，賀 敏?

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院，上海 200437）

子宮脫垂是盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）的主要表現之一，屬于盆底功能障礙性疾病，是中老年女性的常見病，對14 180 例已婚婦女婦科普查情況分析結果顯示51～60 歲的婦女子宮脫垂發(fā)病率為0.33%，60歲以上為0.71%。子宮脫垂雖不威脅生命，但嚴重影響婦女的健康和生活質量［1-2］。

盆底結締組織是盆腔的重要支持成分，以盆底筋膜和韌帶結構為主，其中主韌帶-宮骶韌帶復合體，是盆底最主要的支持力量［1］。膠原是韌帶和筋膜的主要成分，由盆底結締組織中的成纖維細胞生成。盆底結締組織正常支持功能的行使有賴于膠原合成與降解的動態(tài)平衡，膠原代謝狀態(tài)的改變會影響盆底支持組織的強度和彈性從而導致POP 的發(fā)生［1-2］。賴氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase，LOX）、轉化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）、結締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）和核心蛋白聚糖（Decofin，DCN）是影響膠原合成的重要因素?；|金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）及其抑制物（Tissue Inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs）則與膠原降解密切相關，在子宮脫垂患者子宮韌帶組織中MMPs 表達的增加均伴隨著 TIMPs 表達的減少［2-8］。

升陽舉陷治法作為中醫(yī)經典治法之一被廣泛應用于臟器下垂、泄瀉、崩漏等疾病。補中益氣湯是升陽舉陷治法的代表方，治療中氣下陷證子宮脫垂歷史悠久，隨著現代醫(yī)學的發(fā)展，重度子宮脫垂雖已以手術治療為主，但其仍是子宮脫垂治療的重要手段之一［9-11］。

目前，由于中醫(yī)證候模型研究進展緩慢，使得從“病證-治法-方藥”這一中醫(yī)藥傳統(tǒng)觀念出發(fā)，研究中醫(yī)治法理論的設想舉步為艱，中醫(yī)治法理論實驗研究多選用健康動物，或套用現成的西醫(yī)病的模型，影響了具有標準中醫(yī)藥意義的現代研究。

因此，本研究在病證結合、方證相應理論的指導下，參考盆底結締組織膠原代謝異常是子宮脫垂的主要因素和子宮脫垂中氣下陷證患者盆底結締組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原含有量減少的研究進展［1-2，12］，以具體的病證“子宮脫垂之中氣下陷證”為載體，從膠原代謝環(huán)節(jié)探討補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者盆底結締組織的影響。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，清潔級，生產許可證號SCXK（滬）2017-0005，體質量（300±20）g，雌雄各半，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，并在該動物中心進行飼養(yǎng)。

1.2 藥物 參考文獻［9］，補中益氣湯由黃芪18 g、炙甘草9 g、黨參6 g、白術6 g、升麻6 g、柴胡6 g、當歸6 g、橘皮6 g 組成。黃芪配方顆粒（批號1409005）、炙甘草配方顆粒（批號1409149）、黨參配方顆粒（批號1408032）、白術配方顆粒（批號1408136）、升麻配方顆粒（批號140303）、柴胡配方顆粒（批號1408024）、當歸配方顆粒（批號1409140）、橘皮配方顆粒（批號1407024）均購自江陰天江藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑

1.3.1 real-time PCR 檢測試劑 Trizol（美國invitrogen 公司）；PCR 逆轉錄FastQuant RT Kit（With gDNase）、熒光定量PCR 試劑盒SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根生化科技有限公司）；無水乙醇、異丙醇、氯仿（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）。β-actin、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、LOX、CTGF、DCN、TGF-β、MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 和TIMP-3 引物由上海冠泰生物科技有限公司設計合成。序列見表1。

表1 引物序列

1.3.2 Western blot 檢測試劑 蛋白酶磷酸酶抑制劑（美國Thermo Scientific 公司）；Tris、Glycerine、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、APS、N，N，N，N-四甲基乙二胺、30% 丙烯酰胺（美國Biorad 公司）；BCA protein Assay kit、RIPA 裂解液（強）、SDS-PAGE protein loading buffer（碧云天生物技術研究所）；單克隆Anti-Collagen Ⅲ抗體、單克隆Anti-LOX 抗體、單克隆Anti-MMP1 抗體、單克隆Anti-MMP2 抗體、單克隆Anti-TIMP1抗體、多克隆Anti-TIMP3 抗體（英國Abcam 公司）；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP、Rabbit Anti-Goat IgG（H+L）HRP（美國Jackson Immuno 公司）；β-actin 抗體（TIANGEN 生化科技有限公司）。

1.4 儀器 超凈工作臺、HERAcell 240i 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司）；CKX41SF 型倒置顯微鏡、NanoVue 濃度檢測儀（日本Olympus 公司）；centrifuge 5415R 型低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；MQX200R 型微孔板掃描分光光度計、微孔板掃描分光光度計（多功能酶標儀）（美國BIO-TEK 公司）；熒光定量PCR 擴增儀ViiA7（美國life technology 公司）；Cycler PCR 儀、Western blot 電泳系統(tǒng)、轉膜儀（美國Bio Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥物血清制備 將SD 大鼠按體質量隨機分為空白血清組和全方血清組（每天9.47 g／kg），每組6 只，雌雄各半，每天灌胃給藥2 次，連續(xù)3 天，次日晨再灌1 次，空白血清組予同容積的飲用水，末次給藥前禁食12 h。末次給藥1 h 后，在無菌條件下自門靜脈采血，血液樣本靜置3～4 h，4 ℃離心（3 500 r／min、15 min），分離血清，然后將血清置于56 ℃水浴30 min，經0.22 μm 微孔濾膜除菌后，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 原藥全方溶液配制 精密稱取全方配方顆粒10.78 mg，置于10 mL 量瓶中，用PBS 定容至刻度，得質量濃度為1.078 mg／mL 的全方貯備液；精密量取原藥全方貯備液適量，以PBS 作為稀釋液，配制質量濃度為100 μg／mL原藥全方溶液，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 人子宮主韌帶成纖維細胞的培養(yǎng)

2.3.1 病例選擇 在曙光醫(yī)院婦科病房因子宮Ⅲ、Ⅳ度脫垂行盆底重建或子宮切除術的患者（中醫(yī)證屬中氣下陷證），且滿足自然絕經2 年以上，未行激素替代治療。既往無子宮內膜異位癥、婦科惡性腫瘤、糖尿病、結締組織病、慢性盆腔炎癥、盆腔手術史、慢性阻塞性肺病等疾病。

2.3.2 組織標本的采集 開腹或陰式子宮全切術中取患者廢棄的子宮主韌帶組織，分成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小組織1～3 塊，盡量去除可見的脂肪組織及血管組織，用PBS 沖凈。

2.3.3 人子宮主韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)、純化、傳代和鑒定 采用膠原酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)，取回的組織用含1×105U／L 雙抗的PBS 反復清洗3～5 遍，至液體清亮，用眼科剪清除表面壞死組織和脂肪，并快速將組織剪成碎塊，轉入培養(yǎng)瓶中加入1%Ⅰ型膠原酶3 mL，培養(yǎng)箱中消化約3 h，此時肉眼可見液體變渾濁黏稠，組織塊呈明顯蓬松狀，組織轉入離心管，1 500 rpm，離心3 min，棄上清，收集沉淀，予含20% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基5 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內中培養(yǎng)。3 d 后觀察細胞情況，并換液，之后每3～4 天換液1 次，倒掉未貼壁的組織塊和不貼壁的少量紅細胞，貼壁組織及細胞繼續(xù)培養(yǎng)。當生長的細胞鋪滿瓶底70%～80% 時，采用差時貼壁法對培養(yǎng)出的主韌帶細胞進行純化。第2 次純化后的細胞鋪滿瓶底70%～80%時，進行傳代培養(yǎng)。取4 代細胞采用免疫組化法進行成纖維細胞鑒定。4～9 代的細胞用于本實驗。

2.4 藥物毒性實驗 采用CCK-8 試劑盒測定血清毒性。

2.5 分組及給藥 分為全方原藥組、全方血清組、空白血清組和無干預組。全方血清和空白血清分別用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為20%，原藥用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為100 μg／mL，然后加入培養(yǎng)皿中與細胞共同培養(yǎng)；無干預組加入等體積的培養(yǎng)基，均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。

2.6 人子宮主韌帶成纖維細胞總膠原含量測定 按“2.5”項下操作后，收集細胞上清液，采用羥脯氨酸測試盒檢測細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量，操作步驟按說明書執(zhí)行。

2.7 RT-PCR 檢測 按“2.5”項下操作后，采用Trizol 法提取總RNA，然后逆轉錄成cDNA，采用RT-PCR 法檢測各指標mRNA 的相對表達量，操作步驟按說明書執(zhí)行。各組指標均以空白血清組1 為對照的mRNA 表達半定量分析。

2.8 Western blot 檢測 按“2.5”項下操作后，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，將蛋白樣品及標準蛋白與4 倍樣品緩沖液混合后沸水煮5～10 min 變性，每組上樣定量10 μg 蛋白質。使用轉移電泳裝置電轉90～120 min，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。后經封閉，一抗、二抗孵育，顯色；將顯示條帶的膠片加ECL、曝光、顯影、定影；然后計算機掃描蛋白質條帶，通過圖像分析軟件進行分析。以蛋白條帶的灰度值代表蛋白的表達量，用內參蛋白的灰度值進行校正后代表蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 藥物毒性實驗 經純化后培養(yǎng)的細胞為長梭型，波狀蛋白呈陽性，角蛋白呈陰性，提示從子宮主韌帶培養(yǎng)出來的是成纖維細胞。與無干預組比較，20% 大鼠血清組、20%全方血清組和全方原藥組（100 μg／mL）的細胞存活率均無統(tǒng)計學差異。

3.2 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞總膠原含有量、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA 表達的影響 如表2 所示，與空白血清組或無干預組比較，全方血清組和全方原藥組細胞培養(yǎng)液中總膠原的含有量均明顯增加（P＜0.01），全方血清組和全方原藥組子宮主韌帶成纖維細胞的Ⅲ型膠原mRNA 表達均明顯增加（P＜0.01），而Ⅰ型膠原mRNA 的表達無明顯變化。

表2 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞總膠原含量、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA 表達的影響（，n＝10）

表2 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞總膠原含量、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA 表達的影響（，n＝10）

注：與無干預組比較，??P ＜0.01；與空白血清組比較，ΔΔ P＜0.01

3.3 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成、降解相關基因表達的影響 如表3～4所示，與空白血清組或無干預組比較，全方血清組和全方原藥組子宮主韌帶成纖維細胞的LOX mRNA 表達明顯增加（P＜0.01），MMP-2mRNA 表達明顯減少（P＜0.01），且全方原藥組MMP-2mRNA 表達的減少優(yōu)于全方血清組（P＜0.05）；全方血清組子宮主韌帶成纖維細胞的MMP-1 表達明顯減少（P＜0.01），TIMP-1 和TIMP-3 mRNA 表達明顯增加（P＜0.01），且變化優(yōu)于全方原藥組。

表3 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成相關基因mRNA 表達的影響（，n＝3）

表3 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成相關基因mRNA 表達的影響（，n＝3）

注：與無干預組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白血清組比較，ΔΔ P＜0.01。

表4 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原降解相關基因mRNA 表達的影響（，n＝3）

表4 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原降解相關基因mRNA 表達的影響（，n＝3）

注：與無干預組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白血清組比較，ΔΔP＜0.01；與全方原藥組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成、降解相關蛋白表達的影響 如表5 所示，與空白血清組或無干預組比較，全方血清組和全方原藥組子宮主韌帶成纖維細胞的Ⅲ型膠原蛋白表達增加，MMP-2 蛋白表達減少；全方血清組子宮主韌帶成纖維細胞的TIMP-1 和TIMP-3 蛋白表達均增加，MMP-1 蛋白表達減少，且TIMP-1 蛋白表達的增加優(yōu)于全方原藥組。見圖1。

表5 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成、降解相關蛋白表達的影響（，n＝3）

表5 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成、降解相關蛋白表達的影響（，n＝3）

注：與無干預組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白血清組比較，ΔP＜0.05，ΔΔ P＜0.01；與全方原藥組比較，＃＃P＜0.01。

圖1 Western blotting 檢測子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成、降解相關蛋白的表達

4 討論

4.1 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原的影響 膠原主要由盆底結締組織的成纖維細胞生成。Ⅰ和Ⅲ型膠是盆底筋膜、韌帶的主要成分，Ⅰ型膠原直徑較粗，起支持作用，Ⅲ型膠原直徑較細，與彈性有關［1-3］。Ⅲ型膠原減少與子宮脫垂的發(fā)生關系密切［13-17］。本研究結果顯示補中益氣湯能增加子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞總膠原的含量，且以Ⅲ型膠原為主，提示其治療作用與增加膠原含量，進而改善子宮主韌帶結構及功能有關。

4.2 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原合成代謝環(huán)節(jié)的影響 LOX 是膠原纖維發(fā)育成熟和保持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關鍵酶，能影響膠原與彈性纖維的交聯［6，17］。本研究結果顯示補中益氣湯能增加LOX mRNA 的表達，但對LOX 蛋白表達無影響。TGF-β 能夠刺激細胞中膠原mRNA 水平的提高，同時抑制MMPs 的分泌和刺激其抑制物TIMPs 的表達，從而抑制膠原降解［17］。CTGF 可通過介導TGF-β 或自分泌作用刺激膠原合成［2，17］。DCN 通過其核心蛋白與膠原的相互作用調節(jié)膠原纖維的生成速度［18］。本研究未發(fā)現補中益氣湯對TGF-β、CTGF 和DCN 的表達有影響。

4.3 補中益氣湯對子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞膠原分解代謝環(huán)節(jié)的影響 MMPs 是降解膠原最重要的蛋白酶，其中MMP-1 和MMP-2 與POP 的發(fā)生關系尤為密切［19-22］。MMPs 的活性主要通過TIMPs 調節(jié)，TIMPs是MMPs 的特異性抑制物，能抑制MMPs 的活性，從而調節(jié)膠原降解的速率［2，17］。TIMP-1 主要與MMP-1 和MMP-3結合，抑制其對Ⅰ型、Ⅲ型膠原的降解；TIMP-2 不僅能結合激活狀態(tài)的MMP-2，還能結合MMP-2 酶原，并可終止MMPs 家族中所有成員的水解活性；TIMP-3 存在于細胞外基質中，能抑制MMP-2 對膠原的降解［2，17，23-25］。MMPs／TIMPs 的組合與比例，對膠原的降解代謝具有重要影響。本研究結果顯示補中益氣湯能夠降低子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞MMP-1、MMP-2 的表達，增強TIMP-1、TIMP-3 的表達，提示補中益氣湯主要作用于膠原降解環(huán)節(jié)。

另外，本研究結果還發(fā)現，全方含藥血清能降低MMP-1 mRNA 的表達，且優(yōu)于全方原藥；全方含藥血清能增加TIMP-3 和TIMP-1 mRNA 及蛋白的表達，而全方原藥與空白血清對TIMP-3、 TIMP-1 mRNA 及其蛋白的表達均無影響，提示補中益氣湯經體內代謝過程后有效成分的組成和含量可能產生了變化，進而導致其相應的作用點或程度也隨之變化。此現象與文獻報道［26-28］含藥血清與原藥的藥效不一致的現象相似，方劑是一個系統(tǒng)的整體，其用藥的本質是多成分的配伍效應，方劑中除原形成分外，還存在經人體吸收代謝后的成分，這些成分在人體內配伍而產生協(xié)同或拮抗作用，而這些作用整合后表現出具有自身配伍特點的生物學效應［29］。

綜上，本研究結果顯示補中益氣湯能增加子宮脫垂中氣下陷證患者子宮主韌帶成纖維細胞總膠原的含量，且以Ⅲ型膠原為主；其機制與降低成纖維細胞MMP-1 和MMP-2的表達，增加成纖維細胞TIMP-1 和TIMP-3 的表達有關。