UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中7 種成分

李玲慧，李 丹，黃漢明，許 文，徐 偉

（1.福州市中醫(yī)院，福建福州 350001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122）

抗萎平異合劑是福建省福州市中醫(yī)院用于治療脾胃氣虛、氣滯血瘀、熱毒內(nèi)蘊所致慢性萎縮性胃炎的院內(nèi)制劑，由黃芪、黨參、木蝴蝶、蒲公英等十余味中藥組成［1］，具有健脾和胃、理氣活血的功效，臨床療效顯著，對于改善癥狀，減輕或逆轉(zhuǎn)胃黏膜腺體萎縮、腸化、異型增生及清除HP 均有一定作用［2］。但目前關(guān)于抗萎平異合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)相對薄弱，尤其是缺少含量測定指標(biāo)，故本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上對其進行深入考察。

對于復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，北京中醫(yī)藥大學(xué)張世臣教授提出基于全程質(zhì)量控制理念的工業(yè)飲片標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)研究［3］；中國中醫(yī)科學(xué)院劉安課題組提出以質(zhì)量為核心的優(yōu)質(zhì)中成藥評價標(biāo)準(zhǔn)研究［4］；天津中醫(yī)藥大學(xué)劉昌孝院士針對中藥藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥基本屬性的基礎(chǔ)研究薄弱，致使質(zhì)量控制指標(biāo)與中藥傳統(tǒng)功效的關(guān)聯(lián)性不強、質(zhì)量控制指標(biāo)的專屬性差等共性問題，提出發(fā)展中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Qmarker）理論方法和策略，以期提升中藥科學(xué)技術(shù)水平［5］。

近年來，UPLC-MS／MS 被越來越多地應(yīng)用于中藥或復(fù)方分析，它具有更高的分離度和靈敏度，有利于多指標(biāo)成分含量測定，為其合理化質(zhì)控指標(biāo)的選擇提供了定性和定量手段［6-8］；另一方面，建立快速定量分析方法（如UPLC 等）可大大節(jié)省時間和溶劑，為中藥復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了新技術(shù)［9-11］。因此，本實驗通過UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸的含量，再結(jié)合現(xiàn)代中藥質(zhì)控理論選擇木蝴蝶苷B 作為Q-marker［12］，通過UPLC-DAD 法對其含量進行測定，以期為該方質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Xevo TQS 三重四級桿質(zhì)譜、Waters ACQUITY UPLC H-Class（美國 Waters 公司）；CPA225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）；KQ-500DE 型臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 咖啡酸（批號 110885-201703）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606）、甘草苷（批號111610-201607）、木蝴蝶苷B（批號111915-201603）、黨參炔苷（批號111732-201607）、黃芪甲苷（批號 110781-200613）、甘草酸（批號110731-201720）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%?？刮疆惡蟿┯筛Ｖ菔兄嗅t(yī)院提供，批號180314、180321、180328。乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸對照品適量，50%甲醇制備成1 038、1 020、1 162、1 170、904、1011、984 μg／mL 貯備液，精密量取適量，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為25.95、25.5、58.1、585、22.6、50.55、246 μg／mL）。另精密稱取木蝴蝶苷B 對照品10.60 mg，置入50 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制成每l mL 含212 μg該成分的貯備液，進一步稀釋成21.20 μg／mL，搖勻，供UPLC 檢測用。

2.1.2 供試品溶液 精密量取合劑1 mL，置于100 mL 量瓶中，加50%甲醇適量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按照處方比例和工藝，制備不含木蝴蝶的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 各成分含量測定（UPLC-MS／MS 法）

每次來送貨卡車時，登子一早守候在營業(yè)部大門邊，小阿布硬是跟著來了。甲洛洛每次把小阿布帶在身邊，給他一些自己收藏給兒子們的糖果，有時也帶回家里，把剩菜剩飯熱一下，讓小阿布吃個飽。慢慢的，登子不到營業(yè)部卸貨，小阿布也守在營業(yè)部大門邊，只要看到甲洛洛出來，便歡叫著撲進甲洛洛懷里：爺爺，我肚子餓！

2.2.1 UPLC 條件 Waters CORTECS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10% A；0.5～4.0 min，10%～30% A；4.0～6.0 min，30%～60%A；6.0～7.0 min，60%～80%A；7.0～7.1 min，80%～10% A；7.1～10 min，10%A）；體積流量0.25 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.2.2 MS 條件 正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓3.50 kV；脫溶劑氣氮氣，體積流量800 L／h，溫度500 ℃；錐孔氣氮氣，體積流量150 L／h；離子源溫度150 ℃；二級錐孔萃取電壓3.00 V；碰撞氣氬氣。其他參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液20、50、100、200、400、1 000 μL，置于10 mL 量瓶中，50% 甲醇定容后搖勻，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定。以峰面積（Y）對各成分質(zhì)量濃度（X）進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分MS 參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

圖1 各成分UPLC-MS／MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.2.3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定，測得各成分日內(nèi)精密度RSD 分別為咖啡酸4.4%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷3.5%、甘草苷3.2%、木蝴蝶苷B 1.3%、黨參炔苷4.4%、黃芪甲苷2.7%、甘草酸2.5%；日間精密度RSD 分別為咖啡酸4.0%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷4.1%、甘草苷2.2%、木蝴蝶苷B 1.4%、黨參炔苷4.2%、黃芪甲苷2.2%、甘草酸1.4%，表明儀器精密度良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為咖啡酸3.4%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷4.2%、甘草苷2.3%、木蝴蝶苷B 1.1%、黨參炔苷4.1%、黃芪甲苷2.8%、甘草酸1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取合劑（批號180314）6 份，每份0.5 mL，按1 ∶1 比例分別加入對照品溶液，其中咖啡酸（1 038 μg／mL）25 μL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（1 020 μg／mL）30 μL、甘草苷（1 162 μg／mL）100 μL、木蝴蝶苷B（1 170 μg／mL）800 μL、黨參炔苷（904 μg／mL）15 μL、黃芪甲苷（1 011 μg／mL）45 μL、甘草酸（984 μg／mL）50 μL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸平均加樣回收率分別為97.53%、104.30%、98.45%、98.08%、99.31%、102.31%、97.77%，RSD 分別為4.2%、3.6%、4.0%、4.3%、3.3%、3.3%、3.8%。

2.2.4 樣品含量測定 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.3 木蝴蝶苷B 含量測定（UPLC-DAD 法）

2.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%A；0.5～10 min，10%～18% A；10～15 min，18%～25%A；15～15.1 min，25%～10%A；15.1～20 min，10% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長276 nm；進樣量5 μL，色譜圖見圖2。由此可知，木蝴蝶苷B 與其他色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)按該成分計不低于5 000。

圖2 木蝴蝶苷B UPLC-DAD 色譜圖Fig.2 UPLC-DAD chromatograms of baicalein-7-O-gentiobioside

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項下貯備液，制成含 1.060、2.120、4.240、8.480、16.96、33.92 mg／L 木蝴蝶苷 B 的對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以木蝴蝶苷B質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，得方程為Y＝35.20X-2.528（r＝0.999 8），在1.060～33.92 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取合劑（批號180314）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得木蝴蝶苷B含量RSD 為1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 精密度試驗 在同一個實驗室內(nèi)3 個分析人員用同一臺儀器，按“2.3.3”項下方法測定，測得木蝴蝶苷B 含量RSD 為1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得木蝴蝶苷B 峰面積RSD 為1.9%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率實驗 精密量取9 份合劑（180314），每份0.5 mL，分為3 組，每組3 份，分別加入木蝴蝶苷B（212.0 μg／mL）對照品溶液2.3、4.2、6.4 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 木蝴蝶苷B 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of recovery tests for baicalein-7-O-gentiobioside（n＝3）

2.4 樣品含量測定 取3 批合劑，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表5。

表5 木蝴蝶苷B 含量測定結(jié)果（n＝3）Tab.5 Results of content determination of baicalein-7-Ogentiobioside（n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 本實驗以現(xiàn)代中藥質(zhì)控理論和2020 年版《中國藥典》 一部為指導(dǎo)，根據(jù)其中各味中藥飲片含量測定的指標(biāo)成分進行篩選。根據(jù)含量測定結(jié)果結(jié)合Q-marker 理論，發(fā)現(xiàn)抗萎平異合劑中木蝴蝶苷B 含量最高，而且現(xiàn)代藥理研究表明它具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性［13-15］，能通過抗胃炎、抑制幽門螺旋桿菌、抗胃炎氧化應(yīng)激等途徑調(diào)和脾胃［16］，是評價木蝴蝶質(zhì)量的重要Q-marker［17-19］，也可能是復(fù)方功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，故選擇其作為指標(biāo)成分。

3.2 檢測波長篩選 本實驗采用DAD 檢測器在190～400 nm 波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)木蝴蝶苷B 最大吸收波長為276 nm，故選擇其作為檢測波長。

3.3 流動相篩選 參考文獻［20］報道，本實驗考察了甲醇-水、甲醇-水（含0.1% 甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1% 甲酸），發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含0.1%甲酸）洗脫時木蝴蝶苷B 分離效果明顯更優(yōu)，出峰時間適宜，峰形較好，基線穩(wěn)定，能達到系統(tǒng)適用性的要求，故選擇其作為流動相。

3.4 耐用性考察 本實驗考察了Agilent1290、Waters ACQUITY UPLC H-Class、Waters ACQUITY UPLC I-Class 高效液相色譜儀，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Thermo syncronis aQ C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Ultimate UHPLC XB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相0.05%甲酸、0.10%甲酸、0.15%甲酸，體積流量0.25、0.30、0.35 mL／min，柱溫25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)不同條件下木蝴蝶苷B 含量RSD 均小于2%，表明該方法耐用性良好。

4 結(jié)論

本實驗首先通過UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸的含量，在此基礎(chǔ)上結(jié)合含量測定結(jié)果與活性分析，篩選出木蝴蝶苷B 作為指標(biāo)成分，建立UPLC-DAD法測定其含量，可為該方質(zhì)量控制提供參考。

致謝：本項目在福建省科技廳重點實驗室、福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室完成。