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    一種高通量檢測(cè)方法評(píng)估多種殺蟲劑協(xié)同作用于蜜蜂的毒性風(fēng)險(xiǎn)

    2021-03-09 02:30:12劉玉玲李興安王志陳東海牛慶生編譯
    中國(guó)蜂業(yè) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

    劉玉玲 李興安 王志 陳東海 牛慶生│編譯

    吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所,吉林132108

    蜜蜂幾乎總是暴露在殺蟲劑之中。最近,我們進(jìn)行了一項(xiàng)檢測(cè)蜂巢蠟質(zhì)中殺蟲劑殘留的研究,受檢對(duì)象是紐約198名養(yǎng)蜂人的蜂巢蠟質(zhì),結(jié)果顯示197名養(yǎng)蜂人的蜂巢蠟質(zhì)有殺蟲劑殘留,蜂巢蠟質(zhì)平均含有6種殺蟲劑。而這不算糟糕,研究?jī)H是證明蜜蜂通常暴露于低劑量的殺蟲劑。2019年,我們進(jìn)行一項(xiàng)蜂箱飼料中殺蟲劑殘留的研究,受檢對(duì)象是紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料,結(jié)果顯示蜂箱飼料平均含有14種殺蟲劑,而且一些蜂箱飼料最多含有23種殺蟲劑。

    多種殺蟲劑毒作用蜜蜂的現(xiàn)狀給美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)等環(huán)境監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行殺蟲劑風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提出一個(gè)重要問題:如何確定特定環(huán)境下殺蟲劑的使用劑量,以及如何限制其毒作用風(fēng)險(xiǎn)的使用劑量。然而,美國(guó)環(huán)境保護(hù)署和其他環(huán)境監(jiān)管機(jī)構(gòu)僅考慮如何評(píng)估殺蟲劑單獨(dú)使用的毒性風(fēng)險(xiǎn),沒有考慮如何評(píng)估多種殺蟲劑聯(lián)合使用的毒性風(fēng)險(xiǎn)。為此,我們草擬了一個(gè)不算完整的殺蟲劑毒作用風(fēng)險(xiǎn)圖例:首先,蜜蜂在飼養(yǎng)過程中不可避免地接觸殺蟲劑;其次,一些殺蟲劑通過相互作用(即協(xié)同作用)大大增加了自身的毒性,比單一殺蟲劑具有更大的毒作用。

    當(dāng)蜜蜂同時(shí)暴露于數(shù)百種殺蟲劑時(shí),我們?cè)撊绾卧u(píng)估多種殺蟲劑聯(lián)合作用于蜜蜂的毒性風(fēng)險(xiǎn)呢?簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)計(jì)算方法是,如果1只蜜蜂同時(shí)暴露于100種殺蟲劑,那么想評(píng)估2種殺蟲劑組合暴露對(duì)蜜蜂的毒作用,就需要組織4950次實(shí)驗(yàn)才能進(jìn)行總的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估;想評(píng)估3種殺蟲劑組合暴露對(duì)蜜蜂的毒作用,就需要組織161700次實(shí)驗(yàn)才能進(jìn)行總的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。以此類推,該如何評(píng)估14種殺蟲劑組合暴露對(duì)蜜蜂的毒作用?也就是說,需要組織多少次實(shí)驗(yàn)才能獲得上述紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料檢測(cè)結(jié)果呢?答案非常令人吃驚,是44186942677323600次實(shí)驗(yàn)。

    圖1 熒光掃描384微孔板檢測(cè)殺蟲劑干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶催化BCF底物生成基-4-三氟甲基香豆素(HC)產(chǎn)物的技術(shù)原理

    如果要解決這個(gè)重要問題,需要開發(fā)一種快速而有效的篩選方法,以明確蜜蜂是否面臨多種殺蟲劑協(xié)同作用的毒性風(fēng)險(xiǎn)。為了回答這個(gè)問題,我們實(shí)驗(yàn)室提出第39個(gè)研究課題:蜜蜂細(xì)胞色素P450酶用于分子檢測(cè)殺蟲劑毒作用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)。這項(xiàng)研究旨在傳統(tǒng)的評(píng)估殺蟲劑毒性風(fēng)險(xiǎn)基礎(chǔ)上增加一種新方法。Julian Haas和Ralf Nauen將研究成果發(fā)表于美國(guó)環(huán)境科學(xué)類期刊《環(huán)境國(guó)際》(2021,147:106372)。

    通過參考實(shí)驗(yàn)室初步篩選人藥檢測(cè)方法,以確定蜜蜂體內(nèi)是否存在藥物與藥物之間的相互作用。首先,通過體外實(shí)驗(yàn)在384微孔板建立殺蟲劑抑制CYP9Q3解毒酶的活力測(cè)定方法,CYP9Q3解毒酶是細(xì)胞色素P450 基因CYP9Q3編碼的藥物代謝酶異構(gòu)體,能夠?qū)⑾x劑分解為無(wú)毒產(chǎn)物;其次,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)殺蟲劑對(duì)蜜蜂CYP9Q3解毒酶的活力影響;最后,比較體內(nèi)、外檢測(cè)結(jié)果。

    在384微孔板圖片上方,CYP9Q3解毒酶將BFC底物分解為HC產(chǎn)物。在殺蟲劑存在時(shí),CYP9Q3解毒酶不能將BFC全部轉(zhuǎn)化為HC (箭頭顯示),存在兩個(gè)可能:一種原因是殺蟲劑充當(dāng)BFC的競(jìng)爭(zhēng)性底物,也被CYP9Q3解毒酶降解,噻蟲啉(TCP)、啶蟲脒(ACT)等新煙堿類殺蟲劑在蜜蜂體內(nèi)能夠被CYP9Q3解毒酶降解;另一種原因是殺蟲劑充當(dāng)酶的抑制劑,使CYP9Q3解毒酶在降解其他類似底物時(shí)活力降低。稍后我們看到,一些殺真菌劑通過抑制CYP9Q3解毒酶的活性,干擾蜜蜂對(duì)噻蟲啉(TCP)和啶蟲脒(ACT)的解毒能力。在384微孔板圖片下方,微孔板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的不同結(jié)果是:比之于正常的CYP9Q3解毒酶的酶促反應(yīng)(淺色曲線),CYP9Q3解毒酶被殺蟲劑抑制后在添加更多BFC底物時(shí)沒有產(chǎn)生更多數(shù)量HC(深色曲線),這意味著殺蟲劑干擾了CYP9Q3解毒酶的正常催化活性,成為CYP9Q3解毒酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物,或者成為CYP9Q3解毒酶的抑制劑。

    現(xiàn)在看來,微孔板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定蜜蜂CYP9Q3解毒酶的酶活力提供如下3個(gè)方面的研究證據(jù)。首先,蜜蜂CYP9Q3解毒酶是否能夠降解噻蟲啉(TCP)、啶蟲脒(ACT)、吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑(也被用作滅螨劑);其次,三氟咪唑、丙環(huán)唑、三唑酮、環(huán)氧環(huán)唑、烯唑環(huán)唑、丙硫菌唑、丙氯唑和偶氮菌酯等殺真菌劑是否干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶;最后,噻蟲啉(TCP)和啶蟲脒(ACT)是否單獨(dú)毒作用于蜜蜂,還是與殺真菌劑共同毒作用于蜜蜂。比較體外實(shí)驗(yàn)獲得的LC50值與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)獲得的LD50值,就找到了問題的答案。

    微孔板檢測(cè)法是否證明上述殺蟲劑被蜜蜂CYP9Q3解毒酶分解? 一些結(jié)果是肯定的,例如,蜜蜂CYP9Q3解毒酶能分解噻蟲啉(TCP)、啶蟲脒(ACT)和氟纈氨酸;而另外一些結(jié)果是否定的,例如,蜜蜂CYP9Q3解毒酶不能分解吡蟲啉和噻蟲嗪。微孔板檢測(cè)法是否證明上述殺真菌劑抑制蜜蜂CYP9Q3解毒酶? 結(jié)果也是既有肯定的也有否定的。這項(xiàng)研究展示Julian Haas和Ralf Nauen研究成果的新突破,換句話說,就蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制而言,所有殺真菌劑的效果并不相同。

    那么,有證據(jù)表明殺真菌劑與殺蟲劑之間存在協(xié)同性?有,看看蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應(yīng)(LD50)就清楚。微孔板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)通過評(píng)估蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應(yīng)(LD50),可以預(yù)測(cè)啶蟲脒(ACT)與8種殺真菌劑存在協(xié)同作用。此外,還測(cè)試另一種蜜蜂CYP9Q2解毒酶,發(fā)現(xiàn)這個(gè)酶的酶活力下降與蜜蜂死亡率之間存在更好的相關(guān)性。

    顯然,Julian Haas和Ralf Nauen關(guān)于殺蟲劑毒性與蜜蜂致死效應(yīng)之間的相關(guān)分析,提供了一種蜜蜂殺蟲劑毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的檢測(cè)方法,也提高了人們對(duì)殺蟲劑毒作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)水平。鑒于微孔板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)具有高通量分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì),CYP9Q3解毒酶的活性測(cè)定在快速篩選多種農(nóng)藥組合毒性作用方面具有巨大開發(fā)潛力。在本研究中,某些殺蟲劑之間存在強(qiáng)的協(xié)同作用,例如,咪鮮胺(PRC)能夠?qū)⑧缦x啉(TCP)的致蜜蜂急性毒作用水平提高到700倍,而且人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到殺蟲劑協(xié)同作用增加了蜜蜂的致死效應(yīng),因此微孔板檢測(cè)結(jié)果對(duì)美國(guó)環(huán)境保護(hù)署等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的影響被低估了。

    Julian Haas和Ralf Nauen的這項(xiàng)研究提示我們,擴(kuò)大微孔板檢測(cè)范圍(例如,蜜蜂其他解毒酶和其他酶系統(tǒng))會(huì)非常重要。在本研究中,蜜蜂CYP9Q3解毒酶僅對(duì)噻蟲啉(TCP)和啶蟲脒(ACT)等新煙堿類殺蟲劑具有明顯的降解作用,但是對(duì)吡蟲啉、噻蟲嗪等其他新煙堿類殺蟲劑沒有降解作用。蜜蜂CYP9Q3解毒酶對(duì)其他類型殺蟲劑有降解作用嗎?例如,有機(jī)磷殺蟲劑,氨基甲酸酯殺蟲劑,以及最近公布的蜜蜂急性毒性低毒類化學(xué)殺蟲劑?除此之外,還有蜜蜂其他酶或非酶系統(tǒng)用來評(píng)估殺蟲劑協(xié)同毒性?

    Julian Haas和Ralf Nauen通過這項(xiàng)研究向我們開啟了一個(gè)非常重要的研究:我們?cè)撊绾瓮ㄟ^后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明微孔板檢測(cè)方法的可行性,以改進(jìn)蜜蜂暴露于多種殺蟲劑的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。

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