一種高通量檢測方法評估多種殺蟲劑協(xié)同作用于蜜蜂的毒性風(fēng)險

劉玉玲 李興安 王志 陳東海 牛慶生│編譯

吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108

蜜蜂幾乎總是暴露在殺蟲劑之中。最近，我們進(jìn)行了一項(xiàng)檢測蜂巢蠟質(zhì)中殺蟲劑殘留的研究，受檢對象是紐約198名養(yǎng)蜂人的蜂巢蠟質(zhì)，結(jié)果顯示197名養(yǎng)蜂人的蜂巢蠟質(zhì)有殺蟲劑殘留，蜂巢蠟質(zhì)平均含有6種殺蟲劑。而這不算糟糕，研究僅是證明蜜蜂通常暴露于低劑量的殺蟲劑。2019年，我們進(jìn)行一項(xiàng)蜂箱飼料中殺蟲劑殘留的研究，受檢對象是紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料，結(jié)果顯示蜂箱飼料平均含有14種殺蟲劑，而且一些蜂箱飼料最多含有23種殺蟲劑。

多種殺蟲劑毒作用蜜蜂的現(xiàn)狀給美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）等環(huán)境監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行殺蟲劑風(fēng)險評估提出一個重要問題：如何確定特定環(huán)境下殺蟲劑的使用劑量，以及如何限制其毒作用風(fēng)險的使用劑量。然而，美國環(huán)境保護(hù)署和其他環(huán)境監(jiān)管機(jī)構(gòu)僅考慮如何評估殺蟲劑單獨(dú)使用的毒性風(fēng)險，沒有考慮如何評估多種殺蟲劑聯(lián)合使用的毒性風(fēng)險。為此，我們草擬了一個不算完整的殺蟲劑毒作用風(fēng)險圖例：首先，蜜蜂在飼養(yǎng)過程中不可避免地接觸殺蟲劑；其次，一些殺蟲劑通過相互作用（即協(xié)同作用）大大增加了自身的毒性，比單一殺蟲劑具有更大的毒作用。

當(dāng)蜜蜂同時暴露于數(shù)百種殺蟲劑時，我們該如何評估多種殺蟲劑聯(lián)合作用于蜜蜂的毒性風(fēng)險呢？簡單的數(shù)學(xué)計(jì)算方法是，如果1只蜜蜂同時暴露于100種殺蟲劑，那么想評估2種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用，就需要組織4950次實(shí)驗(yàn)才能進(jìn)行總的風(fēng)險評估；想評估3種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用，就需要組織161700次實(shí)驗(yàn)才能進(jìn)行總的風(fēng)險評估。以此類推，該如何評估14種殺蟲劑組合暴露對蜜蜂的毒作用？也就是說，需要組織多少次實(shí)驗(yàn)才能獲得上述紐約蘋果園授粉蜜蜂的蜂箱飼料檢測結(jié)果呢？答案非常令人吃驚，是44186942677323600次實(shí)驗(yàn)。

圖1 熒光掃描384微孔板檢測殺蟲劑干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶催化BCF底物生成基-4-三氟甲基香豆素（HC）產(chǎn)物的技術(shù)原理

如果要解決這個重要問題，需要開發(fā)一種快速而有效的篩選方法，以明確蜜蜂是否面臨多種殺蟲劑協(xié)同作用的毒性風(fēng)險。為了回答這個問題，我們實(shí)驗(yàn)室提出第39個研究課題：蜜蜂細(xì)胞色素P450酶用于分子檢測殺蟲劑毒作用的風(fēng)險評估指標(biāo)。這項(xiàng)研究旨在傳統(tǒng)的評估殺蟲劑毒性風(fēng)險基礎(chǔ)上增加一種新方法。Julian Haas和Ralf Nauen將研究成果發(fā)表于美國環(huán)境科學(xué)類期刊《環(huán)境國際》（2021,147:106372）。

通過參考實(shí)驗(yàn)室初步篩選人藥檢測方法，以確定蜜蜂體內(nèi)是否存在藥物與藥物之間的相互作用。首先，通過體外實(shí)驗(yàn)在384微孔板建立殺蟲劑抑制CYP9Q3解毒酶的活力測定方法，CYP9Q3解毒酶是細(xì)胞色素P450 基因CYP9Q3編碼的藥物代謝酶異構(gòu)體，能夠?qū)⑾x劑分解為無毒產(chǎn)物；其次，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測殺蟲劑對蜜蜂CYP9Q3解毒酶的活力影響；最后，比較體內(nèi)、外檢測結(jié)果。

在384微孔板圖片上方，CYP9Q3解毒酶將BFC底物分解為HC產(chǎn)物。在殺蟲劑存在時，CYP9Q3解毒酶不能將BFC全部轉(zhuǎn)化為HC (箭頭顯示)，存在兩個可能：一種原因是殺蟲劑充當(dāng)BFC的競爭性底物，也被CYP9Q3解毒酶降解，噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）等新煙堿類殺蟲劑在蜜蜂體內(nèi)能夠被CYP9Q3解毒酶降解；另一種原因是殺蟲劑充當(dāng)酶的抑制劑，使CYP9Q3解毒酶在降解其他類似底物時活力降低。稍后我們看到，一些殺真菌劑通過抑制CYP9Q3解毒酶的活性，干擾蜜蜂對噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）的解毒能力。在384微孔板圖片下方，微孔板檢測實(shí)驗(yàn)的不同結(jié)果是：比之于正常的CYP9Q3解毒酶的酶促反應(yīng)（淺色曲線），CYP9Q3解毒酶被殺蟲劑抑制后在添加更多BFC底物時沒有產(chǎn)生更多數(shù)量HC（深色曲線），這意味著殺蟲劑干擾了CYP9Q3解毒酶的正常催化活性，成為CYP9Q3解毒酶的競爭性底物，或者成為CYP9Q3解毒酶的抑制劑。

現(xiàn)在看來，微孔板檢測實(shí)驗(yàn)通過測定蜜蜂CYP9Q3解毒酶的酶活力提供如下3個方面的研究證據(jù)。首先，蜜蜂CYP9Q3解毒酶是否能夠降解噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）、吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑（也被用作滅螨劑）；其次，三氟咪唑、丙環(huán)唑、三唑酮、環(huán)氧環(huán)唑、烯唑環(huán)唑、丙硫菌唑、丙氯唑和偶氮菌酯等殺真菌劑是否干擾蜜蜂CYP9Q3解毒酶；最后，噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）是否單獨(dú)毒作用于蜜蜂，還是與殺真菌劑共同毒作用于蜜蜂。比較體外實(shí)驗(yàn)獲得的LC50值與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)獲得的LD50值，就找到了問題的答案。

微孔板檢測法是否證明上述殺蟲劑被蜜蜂CYP9Q3解毒酶分解? 一些結(jié)果是肯定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶能分解噻蟲啉（TCP）、啶蟲脒（ACT）和氟纈氨酸；而另外一些結(jié)果是否定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶不能分解吡蟲啉和噻蟲嗪。微孔板檢測法是否證明上述殺真菌劑抑制蜜蜂CYP9Q3解毒酶? 結(jié)果也是既有肯定的也有否定的。這項(xiàng)研究展示Julian Haas和Ralf Nauen研究成果的新突破，換句話說，就蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制而言，所有殺真菌劑的效果并不相同。

那么，有證據(jù)表明殺真菌劑與殺蟲劑之間存在協(xié)同性？有，看看蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應(yīng)（LD50）就清楚。微孔板檢測實(shí)驗(yàn)通過評估蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效應(yīng)（LD50），可以預(yù)測啶蟲脒（ACT）與8種殺真菌劑存在協(xié)同作用。此外，還測試另一種蜜蜂CYP9Q2解毒酶，發(fā)現(xiàn)這個酶的酶活力下降與蜜蜂死亡率之間存在更好的相關(guān)性。

顯然，Julian Haas和Ralf Nauen關(guān)于殺蟲劑毒性與蜜蜂致死效應(yīng)之間的相關(guān)分析，提供了一種蜜蜂殺蟲劑毒性風(fēng)險評估的檢測方法，也提高了人們對殺蟲劑毒作用機(jī)制的認(rèn)識水平。鑒于微孔板檢測實(shí)驗(yàn)具有高通量分析的技術(shù)優(yōu)勢，CYP9Q3解毒酶的活性測定在快速篩選多種農(nóng)藥組合毒性作用方面具有巨大開發(fā)潛力。在本研究中，某些殺蟲劑之間存在強(qiáng)的協(xié)同作用，例如，咪鮮胺（PRC）能夠?qū)⑧缦x啉（TCP）的致蜜蜂急性毒作用水平提高到700倍，而且人們已經(jīng)認(rèn)識到殺蟲劑協(xié)同作用增加了蜜蜂的致死效應(yīng)，因此微孔板檢測結(jié)果對美國環(huán)境保護(hù)署等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的影響被低估了。

Julian Haas和Ralf Nauen的這項(xiàng)研究提示我們，擴(kuò)大微孔板檢測范圍（例如，蜜蜂其他解毒酶和其他酶系統(tǒng)）會非常重要。在本研究中，蜜蜂CYP9Q3解毒酶僅對噻蟲啉（TCP）和啶蟲脒（ACT）等新煙堿類殺蟲劑具有明顯的降解作用，但是對吡蟲啉、噻蟲嗪等其他新煙堿類殺蟲劑沒有降解作用。蜜蜂CYP9Q3解毒酶對其他類型殺蟲劑有降解作用嗎？例如，有機(jī)磷殺蟲劑，氨基甲酸酯殺蟲劑，以及最近公布的蜜蜂急性毒性低毒類化學(xué)殺蟲劑？除此之外，還有蜜蜂其他酶或非酶系統(tǒng)用來評估殺蟲劑協(xié)同毒性?

Julian Haas和Ralf Nauen通過這項(xiàng)研究向我們開啟了一個非常重要的研究：我們該如何通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明微孔板檢測方法的可行性，以改進(jìn)蜜蜂暴露于多種殺蟲劑的風(fēng)險評估方法。