STAT3及其多態(tài)性在HPV16所致宮頸癌發(fā)生過程中的作用研究

莫小亮 覃桂榮 蔣曉莉 周卓琳 袁 媛

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院計劃生育病區(qū)，廣西南寧 530021

女性生殖系統(tǒng)常見一類惡性腫瘤為宮頸癌，疾病發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居女性惡性腫瘤第二位。近些年來，宮頸癌疾病呈現(xiàn)上升及年輕化趨勢，成為威脅中青年女性健康的惡性疾病。早期階段宮頸癌癥狀隱匿，缺乏特異性，多數(shù)患者確診就醫(yī)發(fā)展至中晚期，錯過最佳治療時間，患者預(yù)后較差[1]。目前對宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床缺乏敏感、特異的早期診斷方法及有效治療手段[2]。因此，探索宮頸癌發(fā)病相關(guān)分子機(jī)制，尋找腫瘤診斷新型分子標(biāo)志物及治療靶標(biāo)具有重要臨床意義。相關(guān)研究表明[3]，人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染作為宮頸癌發(fā)生重要致病因素，與多個方面因素影響，需全面對致病機(jī)制深入探討。轉(zhuǎn)錄活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等過程，且與腫瘤產(chǎn)生聯(lián)系緊密[4]。本研究旨在探討STAT3 基因表達(dá)及其多態(tài)性在HPV16 所致宮頸癌發(fā)生過程中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2015年1月～2017年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的40 例慢性宮頸炎患者、27 例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者及17 例宮頸癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均經(jīng)臨床確診；②患者及家屬知曉本研究開展經(jīng)過，并自愿參與；③臨床依從性偏高，配合后續(xù)研究開展。排除標(biāo)準(zhǔn)：①中途轉(zhuǎn)院及失訪者；②存在影響研究開展的其他疾病。慢性宮頸炎患者中，年齡27～64 歲，平均（45.6±4.5）歲；病程1～23 個月，平均（6.9±1.5）個月。宮頸上皮內(nèi)瘤病變患者中，年齡29～66 歲，平均（46.2±5.1）歲；病程1～24 個月，平均（7.5±1.4）個月。宮頸癌患者中，年齡29～64 歲，平均（45.9±4.2）歲；病程1～24 個月，平均（7.6±1.3）個月。三組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。另外收集10 名健康體檢者的樣本資料，在PCR-反向點(diǎn)雜交法下展開HPV16 E6 蛋白基因測定，為陰性表達(dá)對照。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

HPV16 E6 蛋白測定：標(biāo)本制作成石蠟組織，切片后進(jìn)行HE 染色，開展分型檢測HPV 亞型，采取聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-反向點(diǎn)雜交法。并采取免疫組化Supervision TM 二步法，檢測標(biāo)本中HPV16 E6 蛋白表達(dá)水平，檢測方法為切片染色，要求病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，HPV16 E6 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒，表達(dá)位置為細(xì)胞核，鏡下染色后，陽性細(xì)胞及染色強(qiáng)度結(jié)果開展半定量評分。依據(jù)細(xì)胞著色深淺分為無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色，分別為0、1、2、3 分，0～1 分為陰性，2 分以上為陽性。

STAT3 基因測定：制備病理組織標(biāo)本，并取各組病例組織5 cm×5 cm，利用10%甲醛固定，石蠟包埋，將其切片為厚度為3 μm 切片，采取HE 染色，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測定STAT3 基因型，構(gòu)建STAT3引物（上游引物：5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′，下游引物：5′-GTTGGGCTCAAATACGGTGG-3′），以β球蛋白基因（350 bp）作為參照基因，取上下游引物各2 μL、DNA 聚合物25 U、氯化鉀50 mmol/L、氯化鎂1.5 mmol/L 及相應(yīng)緩沖液。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，變形30 s，63℃下退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)35 個循環(huán)后72℃延伸5 min，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物基因型。采取PCR-制片段長度多態(tài)性（RFLP）對各組STAT3 基因C1697G 多態(tài)性測定。

1.3 觀察指標(biāo)

采用免疫組化檢測HPV16 E6 在健康體檢者、慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中的表達(dá)。對E6、STAT3 蛋白在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計，比較STAT3 基因多態(tài)性在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌基因中表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者E6、STAT3 蛋白表達(dá)情況的比較

宮頸癌患者的E6 蛋白陽性表達(dá)率（76.47%）高于慢性宮頸炎（2.50%）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（48.14%），STAT3 蛋白陽性表達(dá)率（82.35%）高于宮頸上皮內(nèi)瘤變（44.44%）、慢性宮頸炎（5.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的E6 及STAT3 蛋白陽性表達(dá)率均高于慢性宮頸炎，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者E6、STAT3 蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者STAT3基因多態(tài)性表達(dá)情況的比較

G/G 型占比中，宮頸癌（5.88%）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（59.26%）低于慢性宮頸炎（92.50%），宮頸癌低于宮頸上皮內(nèi)瘤變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C/C 型占比中，宮頸癌（82.35%）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（25.93%）高于慢性宮頸炎（2.50%），宮頸癌高于宮頸上皮內(nèi)瘤變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；慢性宮頸炎（5.00%）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（14.81%）、宮頸癌（11.76%）的G/C 型占比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者STAT3 基因多態(tài)性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.3 典型案例分析

健康體檢者PCR-反向點(diǎn)雜交法下HPV16 E6 蛋白基因測定陰性表達(dá)對照見圖1；慢性宮頸炎患者，45 歲，PCR-反向點(diǎn)雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在慢性宮頸炎患者中的表達(dá)見圖2；宮頸上皮內(nèi)瘤變患者，44 歲，PCR-反向點(diǎn)雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中的表達(dá)見圖3；宮頸癌患者，42 歲，PCR-反向點(diǎn)雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在宮頸癌中的表達(dá)見圖4。

3 討論

婦科常見一類惡性腫瘤為宮頸癌，數(shù)據(jù)顯示每年新發(fā)患病人數(shù)達(dá)到50 萬，占所有婦科癌癥的10.00%，總計發(fā)病率為所有腫瘤的5.00%，僅次于乳腺癌，在發(fā)病地區(qū)統(tǒng)計結(jié)果上，85.00%以發(fā)展中國家為主，占據(jù)所有病例的80.00%[5]。據(jù)統(tǒng)計，全球?qū)m頸癌發(fā)病死亡人數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)為27 萬例，發(fā)展中國家占4/5。對國內(nèi)宮頸癌發(fā)病病例統(tǒng)計顯示，我國占據(jù)全世界總發(fā)病人數(shù)1/3，且每年以2%～3%速度增長，疾病發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢[6]。

圖1 HPV16 E6 表達(dá)陰性對照（免疫組化，100×）

圖2 HPV16 E6 在慢性宮頸炎中的表達(dá)（免疫組化，100×）

圖3 HPV16 E6 在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)（免疫組化，100×）

圖4 HPV16 E6 在宮頸癌中的表達(dá)（免疫組化，100×）

相關(guān)研究證實(shí)[7]，絕大多數(shù)宮頸上皮不典型增生、宮頸癌患者中，經(jīng)檢測存在HPV 感染。99.7%宮頸癌標(biāo)本中可檢測出HPV-DNA。HPV 感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌惡性病變有顯著聯(lián)系。因此，HPV 感染可作為宮頸癌病變重要前提。隨著HPV 感染人群數(shù)量增多，宮頸癌發(fā)病人群數(shù)量相對提升，但HPV 感染嚴(yán)重病變程度作為宮頸癌發(fā)病重要前提，其他外界因素同樣占據(jù)重要地位，如飲食、衛(wèi)生習(xí)慣等，表明疾病形成是多種致癌因素長期共同作用的結(jié)果[8]。STAT 作為介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，是JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)導(dǎo)始于細(xì)胞表面受體，當(dāng)成分與特異性DNA 啟動子序列結(jié)合，信號轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，并調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及血管形成過程，在腫瘤發(fā)生中起著重要作用[9-10]。STAT3 位于11 號染色體，并被多種細(xì)胞因子激活，功能復(fù)雜。正常生理狀態(tài)下，STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在多種生理過程中發(fā)揮重要作用，如胚胎發(fā)育、器官形成、先天及后天免疫調(diào)節(jié)。同樣，當(dāng)機(jī)體感染多種致癌蛋白后，STAT3 被激活，如V-Src、V-Fps、V-Erk 等，上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-XL、Mcl-1 及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因cyclinDl抑制細(xì)胞凋亡，激活血管內(nèi)皮生長因子啟動子，可誘導(dǎo)腫瘤血管生成。STAT3 組成性活化能阻斷凋亡細(xì)胞惡化轉(zhuǎn)化，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管形成，阻斷STAT3表達(dá)對腫瘤的治療具有巨大的潛在價值。

本研究檢測了HPV16 E6 及STAT3 蛋白、STAT3基因多態(tài)性的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，宮頸癌患者的STAT3 蛋白陽性表達(dá)率（82.35%）高于宮頸上皮內(nèi)瘤變（44.44%）、慢性宮頸炎（5.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有研究證實(shí)[11]，STAT3 的組成性活化能促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并阻斷調(diào)亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，血管形成，在人類子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌中處于活性狀態(tài)，當(dāng)抑制STAT3 組成型激活可能是干預(yù)這兩類婦科疾病有效靶點(diǎn)。鑒于STAT3 的致癌作用，本研究將其與宮頸癌密切相關(guān)的HPV16 E6 蛋白相結(jié)合，分析二者在不同程度宮頸病變組織中的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，STAT3 在宮頸癌表達(dá)水平與癌前病變水平呈現(xiàn)顯著差異，隨著宮頸病變程度加重，STAT3 表達(dá)陽性率相應(yīng)升高，與本研究得出的論點(diǎn)一致。同時還有研究發(fā)現(xiàn)[13]，HPV16 E6 蛋白及STAT3 在宮頸癌中表達(dá)具有一定相關(guān)性。因此，惡性腫瘤轉(zhuǎn)化中，HPV16 與STAT3 之間存在某種相互關(guān)系。甚至有相關(guān)研究[14]指出，惡性組織切片中，HPV DNA 整合增加編碼E6、E7 癌蛋白的mRNA 的穩(wěn)定性，導(dǎo)致E6、E7癌蛋白表達(dá)增強(qiáng)，對細(xì)胞與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子造成影響。STAT3 作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，與HPV E6 與之間必然存在著某種關(guān)系，但其與STAT3 在宿主宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的相互作用機(jī)制仍需深入探究?；蚨鄳B(tài)性是目前研究熱點(diǎn)，當(dāng)一個基因多態(tài)性發(fā)生改變時可引起其他基因型發(fā)生相應(yīng)改變，進(jìn)而引發(fā)相關(guān)疾病，基因多態(tài)性可作為疾病診斷依據(jù)及預(yù)后判斷重要指標(biāo)。STAT3 基因多態(tài)性分包括G/G 型、G/C 型、C/C 型，本研究進(jìn)一步對STAT3 基因多態(tài)性進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變的G/G 型占比（5.88%、59.26%）低于慢性宮頸炎（92.50%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的C/C 型占比分別為2.50%、25.93%、82.35%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此，HPV 感染風(fēng)險上升，宮頸癌發(fā)生風(fēng)險上升，C/C 基因占比伴隨疾病程度增加，則整體患宮頸癌機(jī)率增高。Zhou 等[15]研究指出，隨著宮頸病變程度加重，患者STAT3 基因C/C 型顯著增高，G/G 型占比降低，提示宮頸癌發(fā)生與STAT3 聯(lián)系緊密，C/C 基因型與HPV 感染風(fēng)險上呈現(xiàn)正比關(guān)系。STAT3 基因突變可增加HPV 感染風(fēng)險以及宮頸癌患病風(fēng)險，其發(fā)病機(jī)制往往與HPV 感染后激活STAT3 信號通路，介導(dǎo)E6、E7 致癌蛋白通路相關(guān)，致癌蛋白經(jīng)多種途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡化及血管形成宮頸癌[16]。宮頸癌產(chǎn)生為多種因素共同影響結(jié)果，此時STAT3 基因突變，增加HPV16 感染風(fēng)險及宮頸癌風(fēng)險，提示STAT3 在宮頸癌發(fā)生、病情發(fā)展中起著重要作用，可作為臨床診斷重要指標(biāo)。

綜上所述，STAT3 與HPV16 所致宮頸癌發(fā)生聯(lián)系緊密，提示STAT3 和HPV16 在宮頸病變發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。