急性腦梗死患者的脂肪酸代謝組學(xué)相關(guān)性分析

唐 詩， 田步先

腦卒中在全球發(fā)病率位居第三，死亡率位居第二，其中急性腦梗死占69.6%～70.8%[1]。腦梗死是由于多種原因?qū)е履X部血管發(fā)生阻塞，使血管內(nèi)血流被阻斷或減少，導(dǎo)致阻塞部位腦細(xì)胞迅速死亡而引起神經(jīng)功能障礙的一種疾病。腦梗死導(dǎo)致的缺血性病理生理改變并非完全不可逆。如果可以及時恢復(fù)受損腦組織部位的血流，則缺血半暗帶區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的功能可以得到部分恢復(fù)。

脂質(zhì)組學(xué)(Lipidomics)由Han等人于2003年首次提出，其系統(tǒng)分析生物體中脂質(zhì)代謝物質(zhì)的變化特征，以及脂質(zhì)介導(dǎo)的信號通路，為探討疾病的發(fā)病機(jī)制提供一種新方法[2]。脂質(zhì)組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化[3]、糖尿病[4]、阿爾茲海默[5]、腫瘤[6]等多種疾病的診斷及治療中。目前，基于脂質(zhì)組學(xué)探討急性腦梗死發(fā)病與血漿游離脂肪酸(FFA)代謝物變化的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本文采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析腦梗死組和對照組的脂質(zhì)代謝譜，篩選兩組間的差異性FFA代謝物，盡可能為以后探討腦梗死發(fā)病機(jī)制提供一種新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 此研究中選擇2019年10月-2021年1月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的260例急性腦梗死患者為研究組，體檢中心非腦血管病志愿者200例為對照組。對照組與腦梗死組的年齡及性別盡量相匹配，減少其他因素對脂質(zhì)代謝組學(xué)分析所造成的誤差。研究組入選標(biāo)準(zhǔn)：參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018年》[1](1)患者具有神經(jīng)功能缺損癥狀或體征；(2)癥狀或體征時間不超過2 w；(3)頭部CT或DWI影像學(xué)檢查顯示新發(fā)責(zé)任病灶。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無神經(jīng)功能缺損癥狀或體征；(2)頭部CT檢查排除新發(fā)梗死病灶及其他顱內(nèi)器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎等重要臟器功能嚴(yán)重衰竭者；(2)糖尿病、甲狀腺疾病、高尿酸血癥、痛風(fēng)等代謝性疾?。?3)惡性腫瘤及自身免疫性疾病者。此研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所有研究對象在空腹8 h后，由醫(yī)務(wù)人員經(jīng)由肘窩靜脈采取靜脈血漿樣本(肝素鋰抗凝)，2 h之內(nèi)進(jìn)行離心(3000 r，10 min)，取上清液置于EP管內(nèi)，-80 ℃冷凍保持，送至我院遺傳代謝中心進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測，檢測方法可見參考文獻(xiàn)[7]，共測得25個游離脂肪酸代謝物指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析 本研究納入了460例研究對象，其中研究組260例，對照組200例。研究組與對照組在年齡、性別、高血壓、冠心病、吸煙及飲酒史方面無明顯差異性(見表1)。

2.2 正交偏最小二乘法(OPLS-DA) 應(yīng)用多元分析OPLA-DA法對兩組進(jìn)行模式判別分析，并建立散點(diǎn)圖(見圖1)。從散點(diǎn)圖可以看出研究組與對照組之間分離比較明顯，得到R2X=0.449、R2Y=0.68、Q2=0.657，R2Y與Q2(cum)之間差值<0.3，同時Q2>0.5，提示模型的解釋和預(yù)測能力較強(qiáng)。經(jīng)200次Permutation置換檢驗(見圖2)，得出截距：R2(0.0，0.0241)，Q2(0.0，-0.0851)，Q2回歸曲線與y軸截距<0，說明OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象。

2.3 差異代謝物的篩選 篩選血漿中25個游離脂肪酸代謝物。VIP值可以用于篩選對模型貢獻(xiàn)較大的變量。ROC曲線可以評估代謝物的鑒別能力、靈敏度和特異性。AUC值(ROC曲線下面積)可以評估潛在代謝物預(yù)測疾病的能力，AUC值越接近1其診斷能力越高，AUC>0.7表示具有中等及以上的診斷價值。經(jīng)分析篩選獲得10個同時滿足VIP>1.0、AUC>0.7、P<0.01條件的代謝物(見表2)。

2.4 Logistic回歸分析與驗證

2.4.1 Logistic回歸分析 對上述所篩選出的10個FFA代謝物進(jìn)行二元Logistic回歸分析(見表3)。結(jié)果示棕櫚酸(PA)、硬脂酸(SA)、亞油酸(LA)、油酸(OA)、花生四烯酸(AA)是兩組間顯著差異性代謝物(P<0.05)。據(jù)此建立回歸方程Y=14.54-0.001*PA-0.004*SA-0.001*LA-0.001*OA-0.002*AA，該方程可作為預(yù)測腦梗死發(fā)生概率的模型。根據(jù)此回歸方程，得出綜合性指標(biāo)W。上述5個FFA代謝物與綜合性指標(biāo)W在兩組間的表達(dá)差異見小提琴圖(見圖3)。

表1 研究對象一般臨床資料

表2 篩選兩組主要差異代謝物

2.4.2 驗證模型預(yù)測能力準(zhǔn)確性 應(yīng)用ROC曲線驗證模型的準(zhǔn)確性(見圖4)。篩選出來的5種FFA代謝物的AUC值均大于0.7，綜合指標(biāo)W的AUC值為0.917，說明該模型預(yù)測腦梗死的能力較高，并且多種代謝指標(biāo)結(jié)合會提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。

表3 二元Logistic回歸分析中的變量

圖1 OPLS-DA散點(diǎn)圖(1：研究組：綠色；2：對照組：藍(lán)色)

圖2 Permutation檢驗(1：研究組：綠色；2：對照組：藍(lán)色)

圖3 小提琴圖。其中每一個點(diǎn)代表一個統(tǒng)計量，中心紅點(diǎn)代表該項代謝物的中位數(shù)

圖4 ROC曲線圖

3 討 論

腦卒中的發(fā)病率及死亡率在全球一直居高不下，及時有效的治療十分有必要。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，小分子代謝物的精確檢測逐漸成為可能。本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對游離脂肪酸譜代謝物進(jìn)行分析，尋找腦梗死組和對照組之間的代謝差異。

本研究對血漿FFA代謝物進(jìn)行分析篩選，發(fā)現(xiàn)5個FFA代謝物與急性腦梗死具有一定相關(guān)性。與對照組相比，腦梗死組中棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

FFA是人體代謝過程重要的能源物質(zhì)之一，其含量與心腦血管疾病有著密切地聯(lián)系。神經(jīng)細(xì)胞對缺血缺氧十分敏感，當(dāng)腦組織缺血缺氧時，葡萄糖氧化磷酸化障礙，ATP合成減少，機(jī)體通過分解脂肪酸來調(diào)節(jié)能量[8]。在本研究中，腦梗死組中棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸增加，可能與疾病急性期維持能量穩(wěn)態(tài)，脂肪酸分解代謝的增加有關(guān)。

動脈硬化是可以累及全身動脈導(dǎo)致血管疾病的慢性炎癥性疾病。頸動脈硬化不僅是腦梗死主要危險因素，也是疾病復(fù)發(fā)的危險因素。Vorkas PA等研究發(fā)現(xiàn)[9]，花生四烯酸在有局灶性神經(jīng)癥狀的頸動脈斑塊組的小鼠血漿中較無癥狀組含量顯著升高，具有較好的預(yù)測卒中風(fēng)險能力?；ㄉ南┧峥梢栽黾拥兔芏戎鞍?LDL)對氧化的敏感性[10]，還可以通過激活、聚集血小板，形成微血栓[11]。馬陽陽等人[12]發(fā)現(xiàn)硬脂酸在大動脈粥樣硬化型(LAA)中水平明顯升高，且與LDL呈正相關(guān)，原因可能與其增加LDL的濃度，促進(jìn)動脈硬化的形成有關(guān)。巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積是動脈粥樣斑塊形成的關(guān)鍵步驟，過多的脂質(zhì)沉積可以增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷腦細(xì)胞。棕櫚酸可以增加FABP-4和DGAT蛋白的表達(dá)，減低CPT-1表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增多，加速腦梗死的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果表明，硬脂酸和棕櫚酸在腦梗死患者血漿中含量明顯升高，其原因可能與其參與了動脈硬化的發(fā)生與發(fā)展過程相關(guān)。此外硬脂酸還可以激活凝血因子Ⅶ促進(jìn)血栓的形成[14]。

高血壓與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在動脈硬化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中相輔相成。NO具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮舒張的功能，在控制血壓方面發(fā)揮重要作用。FFA可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+和一氧化碳合酶，導(dǎo)致一氧化碳(NO)合成減少[15]。Lu Yihong等發(fā)現(xiàn)[16]，在自發(fā)性高血壓的小鼠血漿中油酸、亞油酸和十六烷酸等FFA的水平隨著血壓的增高而升高，容易誘發(fā)腦血管疾病。本研究結(jié)果示腦梗死組血漿中亞油酸和油酸水平升高，其機(jī)制可能與脂肪酸代謝異常有關(guān)，使得血管舒張功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生。此外，油酸和亞油酸屬不飽和脂肪酸，其分子結(jié)構(gòu)中含有易被氧化的雙鍵，可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，破壞腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。Xin Wang等研究發(fā)現(xiàn)[17]，腦梗死患者血漿中的亞油酸、油酸、DHA等多種FFA的水平升高。研究結(jié)果與本研究基本一致。但Shuai Yuan等研究得出亞油酸和油酸與大動脈型卒中呈負(fù)相關(guān)，花生四烯酸和硬脂酸呈正相關(guān)[18]。該項研究結(jié)論與本研究不盡相同，具體的機(jī)制還需更深層次研究。另外，C16∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶2水平在腦缺血再灌注的小鼠血漿中明顯升高，亞油酸代謝途徑變化較為顯著，因此控制亞油酸的水平可以預(yù)防及治療缺血再灌注損傷[19]。FFA代謝異常與卒中后抑郁的發(fā)生也具有一定相關(guān)性，棕櫚酸、亞油酸、油酸等7代謝物在腦卒中后抑郁的患者血漿中明顯升高，這可能與卒中后期患者發(fā)生失代償改變有關(guān)[20]。

基于本文的研究,我們發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸可作為急性腦梗死的潛在生物標(biāo)志物,并建立了預(yù)測能力良好的判別模型，這將為探討急性腦梗死疾病的發(fā)病機(jī)制提供了一些參考信息。本研究為單中心臨床研究，有很多局限性。研究中存在其他不可控因素可能導(dǎo)致個體代謝差異，因此同一患者疾病前后血漿樣本縱向分析十分必要。此外，本研究樣本量相對較小，尚未將全部脂質(zhì)代謝物納入研究，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步完善與優(yōu)化試驗。