Rho激酶抑制劑介導(dǎo)RhoA/ROCK2通路對(duì)VaD大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制

胡躍強(qiáng)， 向軍軍， 鄧秋媚， 吳 林， 莫雪妮， 陳 煒， 姚 春

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是指由一系列腦血管因素引起的在腦組織損害基礎(chǔ)上產(chǎn)生的以高級(jí)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的臨床綜合征[1,2]。其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但臨床療效也不甚理想[3]。因此，對(duì)于VaD的機(jī)制及治療研究顯得十分迫切。新近研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白R(shí)hoGTP酶亞家族(ras homolog gene family member A，RhoA)/Rho激酶(rho-associated protein kinase,ROCK)通路在軸突生長(zhǎng)分化、樹突棘形成和維持以及記憶過程中起重要作用[4]。在認(rèn)知障礙患者腦組織中，RhoA/ROCK2活性上調(diào)[5]，而降低ROCK2的表達(dá)，或者抑制Rho或ROCK2的活性均可減緩認(rèn)知障礙的發(fā)展[6]，故其有望成為治療VaD的重要靶點(diǎn)。本研究采用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)基因干擾技術(shù)表達(dá)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(Short hairpin RNA,shRNA)抑制RhoA/ROCK2信號(hào)通路，觀察其對(duì)VaD大鼠的影響，以期為防治本病提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，3月齡，體重(250±50)g，由湖南斯萊克景達(dá)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK湘2019-0004。隨機(jī)分成4組(n=10)：假手術(shù)組、模型組、ROCK2干擾組(腺相關(guān)病毒)、對(duì)照組(ROCK2空載體病毒)。

1.2 藥物制備及主要儀器試劑 (1)實(shí)驗(yàn)藥物 AAV9-ROCK2-shRNA注射液及空載體病毒：由上海吉滿生物科技有限公司制造;(2)主要試劑:引物及內(nèi)參(天根生物科技有限公司)，BCA試劑盒、β-actin抗體(碧云天生物公司)；兔抗RhoA多克隆抗體、兔抗ROCK2單克隆抗體、兔抗MLC多克隆抗體(美國Abcam)；兔抗MLCP單克隆抗體(北京Bioss)。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼八幬锔深A(yù)方法 參照文獻(xiàn)制備VaD大鼠模型[7]，評(píng)估模型成功后，將AAV-ROCK2-shRNA原液稀釋至5.07E+12VG/ml，采用腦立體定位儀將ROCK2干擾劑注射海馬組織，每只動(dòng)物注射總量4 μl，持續(xù)5 min；陰性對(duì)照組注射等量空載體病毒。術(shù)后各組大鼠正常喂養(yǎng)，觀察4 w。

1.4 指標(biāo)觀察

1.4.1 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 定位航行實(shí)驗(yàn)：第1周、第4周，每組大鼠每天上下午從4個(gè)象項(xiàng)各訓(xùn)練一次，將大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間設(shè)置為120 s，記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，此作為大鼠空間學(xué)習(xí)能力的檢測(cè)指標(biāo)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)：大鼠完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，于第1周、第4周進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤走平臺(tái)，依次將大鼠從4個(gè)象限放入水中，分別記錄其跨越原來平臺(tái)的次數(shù)作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)測(cè)各組大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP mRNA表達(dá) 取海馬組織置于1 ml EP管內(nèi)，在-80 ℃條件下保存，總RNA運(yùn)用Trizol法提取，提取完成后取2 μg RNA開始逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：β-actin：上游5’-GCGCAAGTACTCTGTGTGG-3’，下游5’-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3’;RhoA上游5’-AGGATTGGCGCTTTTGGGTA-3’，下游5’-TTCACAAGATGAGGCACCCC-3’；ROCK2上游5’-ACAAACCAAGCTAACTGCCT-3’，下游5’-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3’;MLC上游5’-CTCGGACGAGTGAACGTGAA-3’，下游5’-GAGAACCTCTCTGCTTGCGT-3’；MLCP上游5’-CCCGAGGAT GTGATCACTGG-3’，下游5’-TGCGGCTACAAGCCTATCTG-3’。逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)，最后完成72 ℃總延伸5 min，每組各取5 μl PCR產(chǎn)物電泳，凝膠成像儀獲取圖像，2-△△CT對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。

1.4.3 Western blot檢測(cè)大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白表達(dá) 按說明書提取各組大鼠海馬組織蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定并調(diào)整每個(gè)樣本蛋白濃度之后上樣，連接電泳裝置及電源，電壓設(shè)為120 V恒壓，1.5 h后停止電泳；用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)室溫封閉膜2 h，用新配制的封閉液稀釋抗體4 ℃孕育過夜；用封閉液稀釋各蛋白一抗對(duì)應(yīng)的二抗，室溫下孵育膜1 h，用PBST洗膜用于圖像采集；加ECL工作液，在凝膠成像儀下曝光成像，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度(OD)值，內(nèi)參為β-actin，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對(duì)值。

1.4.4 透射電鏡觀察海馬病理變化 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出腦組織，取2 mm×2 mm×2 mm大小的右側(cè)海馬CA1區(qū)組織1塊，置于2.5%戊二醛預(yù)固定然后入1%鋨酸繼續(xù)固定，經(jīng)70%、80%、95%乙醇、無水丙酮脫水、環(huán)氧樹脂Epon812浸透和包埋，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)超薄切片，厚度約4 μm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織的結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)檢測(cè) 組間比較，術(shù)前各組大鼠潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1 w，模型組、陰性對(duì)照組與ROCK2干擾組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01或0.05)；術(shù)后4 w，與模型組比較，ROCK2干擾組潛伏期縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)，陰性對(duì)照組潛伏期時(shí)間與跨越平臺(tái)次數(shù)較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及陰性對(duì)照組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，ROCK2干擾組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP表達(dá)量mRNA含量顯著下降(P<0.05)，模型組與陰性比較四者的mRNA表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)(見表2)。

2.3 各組大鼠RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白的表達(dá)變化 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組及陰性對(duì)照組RhoA、ROCK2、MLC、MLCP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，ROCK2干擾組四者表達(dá)顯著下降(P<0.05)；模型組與陰性對(duì)照組比較四者的蛋白表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)(見表3、圖1)。

2.4 電鏡觀察大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化 如圖2所示，假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)正常且清晰，突觸前膜有大量球形突觸小泡，可見清晰的線粒體，突觸間隙寬度及形態(tài)正常，突觸后膜厚度正常且均勻；模型組與陰性對(duì)照組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰，突觸小泡分布零散且形態(tài)模糊；ROCK2干擾組突觸結(jié)構(gòu)清晰，前膜和后膜形態(tài)正常，可見清晰的線粒體結(jié)構(gòu)，突觸間隙寬度正常(見圖2)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)比較

表2 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化

表3 各組大鼠RhoA/ROCK2通路相關(guān)蛋白OD值的表達(dá)水平比較(n=5)

(1～4道分別代表假手術(shù)組、模型組、ROCK2干擾組、陰性對(duì)照組) (×10000，A：假手術(shù)組；B：模型組；C：ROCK2干擾組；D：陰性對(duì)照組)

3 討 論

RhoA/ROCK信號(hào)通路被稱為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)器，也是細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器[8]。在神經(jīng)發(fā)育過程中，Rho/ROCK信號(hào)通路參與軸突生長(zhǎng)及軸突生長(zhǎng)抑制因子到生長(zhǎng)錐的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)換能過程[9,10]，在傳導(dǎo)髓磷脂相關(guān)抑制因子引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、生長(zhǎng)錐塌陷及抑制神經(jīng)突起延伸過程中起著關(guān)鍵作用，已成為神經(jīng)損傷發(fā)生的重要病理機(jī)制[11]。激活后的RhoA/ROCK2可以影響許多生物學(xué)行為，包括細(xì)胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)突觸可塑性，而抑制Rho/ROCK信號(hào)通路可促進(jìn)軸突再生及神經(jīng)功能恢復(fù)[12]。

肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是Rho激酶(ROCK2)下游底物之一，其表達(dá)與突觸再生密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的MLC磷酸化水平對(duì)調(diào)節(jié)突出再生起到重要作用，在肌球蛋白輕鏈激酶和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)雙重調(diào)節(jié)下，MLC發(fā)生磷酸化和去磷酸化的相互轉(zhuǎn)化[13]。

研究已證實(shí)，過表達(dá)的MLC可增加與肌動(dòng)蛋白絲交聯(lián)產(chǎn)生的收縮力，最終造成細(xì)胞骨架的重排和軸突生長(zhǎng)的抑制，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷、回縮，抑制軸突生長(zhǎng)[12]。抑制Rho/ROCK通路可減少M(fèi)LCP的肌球蛋白結(jié)合亞單位，降低MLCP的磷酸酶活性，減少M(fèi)LC磷酸基團(tuán)的水解；換言之，抑制RhoA/ROCK2可改善細(xì)胞骨架重排、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，這可能成為治療VaD的新靶標(biāo)。因此，本研究通過檢測(cè)VaD大鼠海馬RhoA/ROCK2通路及下游MLC、MLCP的表達(dá)情況，證實(shí)沉默ROCK2表達(dá)可導(dǎo)致海馬組織中RhoA、ROCK2、MLC、MLCP的表達(dá)顯著下調(diào)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。國內(nèi)陳玲麗通過制作氟致小鼠智力損傷模型，得出相似的研究結(jié)果[14]。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，我們認(rèn)為具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達(dá)等特性腺相關(guān)病毒(AAV)載體[15]轉(zhuǎn)染的ROCK2抑制劑可能通過抑制Rho/ROCK信號(hào)通路及其下游分子的傳導(dǎo)，進(jìn)一步促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)及神經(jīng)元的修復(fù)，從而改善智能，其機(jī)制值得進(jìn)一步探索。