非同義單核苷酸變異致病性預測研究綜述

葛 芳,胡 俊,朱一亨,於東軍

(1.南京理工大學 計算機科學與工程學院,江蘇 南京 210094;2.數(shù)據(jù)科學與智能應用福建省高校重點實驗室,福建 漳州363000;3.浙江工業(yè)大學 信息工程學院,浙江 杭州 310023)

在生命體內(nèi),遺傳變異(如基因型或表型變異)可能會導致蛋白質(zhì)結構的改變,對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、功能產(chǎn)生影響[1,2],從而導致疾病的發(fā)生,如骨髓增生性疾病、腎上腺腫瘤、腦癌等[2,3]。由此可見,遺傳變異與人類身體健康關系密切。隨著生物技術進步,全基因組/全外顯子組測序成本降低,從人類基因組中鑒定出的遺傳變異數(shù)量也在劇增。通常,這些鑒定出的變異分為5類,分別是染色體非整倍性(Chromosomal aneuploidy,CA)[4]、結構變異(Structural variations,SV)[5]、復制數(shù)變異(Copy number variations,CNVs)[6]、短插入/刪除(Short insertion/deletions,indels)[7]和單核苷酸變異(Single nucleotide variations,SNVs)[8]。發(fā)生在編碼區(qū)的SNVs,又被劃分為同義(Synonymous)和非同義(Non-synonymous)兩種類別[9]。在上述人類遺傳變異的研究中,突變和變異是兩個常見的概念。相關學者把全球人類群體作為一個整體,在小于 1%的人群中檢測到的變異,稱為突變(Mutation);反之,大于1%的變異稱為多態(tài)性(Polymorphism);變異(Variations)是突變和多態(tài)性的統(tǒng)稱[10]。多態(tài)通常表現(xiàn)為人類身體外觀的改變,如膚色、身高、眼睛等,并不具備致病性;而突變極有可能引起人類疾病,影響人類生存[10,11]。

在所有的人類遺傳變異類型中,非同義單核苷酸變異(Non-synonymous single nucleotide variations,nsSNVs)約占90%[12]。已有研究表明,近三分之一的nsSNVs對人體健康有害,可導致疾病[3]。據(jù)記載,超過6 000種的人類疾病是由該類變異引起的,例如:囊胞性纖維癥、馬方綜合征、早老性癡呆、癌癥等[11]。除了對人體有害的nsSNVs外,還有約三分之二的nsSNVs并沒有改變蛋白質(zhì)的結構和功能表達,對人體并不構成危害,表現(xiàn)為中性。如前所述,有害的nsSNVs可導致一般性疾病,甚至可導致癌癥。針對癌癥而言,在癌癥基因組中檢測到的大部分氨基酸替換對癌癥產(chǎn)生和發(fā)展的影響很小或者沒有影響,此類nsSNVs稱為乘客突變(Passenger mutation),僅有小一部分nsSNVs會導致癌癥,被稱為驅(qū)動突變(Driver mutation),如血癌、口腔癌等[13-15]。準確地區(qū)分驅(qū)動突變和乘客突變,對癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和治療有著重大意義。

下一代測序技術的最新進展為人類基因組分析提供了大量的突變數(shù)據(jù),及時有效地鑒別出與疾病相關的突變顯得十分有必要[11]。在傳統(tǒng)生物醫(yī)學上,臨床醫(yī)生往往通過分析患者的基因測序數(shù)據(jù),判斷該患者的病癥是否為nsSNVs所引起。由于基因測序數(shù)據(jù)的記錄不完整、未考慮家族病史、對數(shù)據(jù)分析不夠全面等,臨床醫(yī)生往往不能快速準確地判斷檢測出的變異是否具有致病性,從而給治療方案的設計帶來不便[16]。同時,傳統(tǒng)生物醫(yī)學手段很難發(fā)現(xiàn)尚未引發(fā)疾病的致病性nsSNVs,無法指導人們做好預防工作。此外,利用傳統(tǒng)生物醫(yī)學手段來判斷nsSNVs是否具有致病性的周期長、代價高。為了解決上述問題,相關研究學者利用生物計算技術來預測nsSNVs致病性,提出了多種快速準確的預測方法[17-19],這些方法有助于了解遺傳疾病的發(fā)病機制,對制定疾病預防策略及對應新藥物設計等有著至關重要的意義[20-22]。

1 非同義單核苷酸變異

一個人基因組中大約有300萬個SNVs,約占人體基因組所有堿基的千分之一[23]。這種變異可能發(fā)生在基因間區(qū)、啟動子區(qū)、編碼區(qū)、UTR區(qū)(Untranslated region),或者某些非編碼核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)區(qū)[24]發(fā)生在編碼區(qū)的SNVs有同義突變(Synonymous mutation)和非同義突變(Non-synonymous mutation)兩種類別。非同義突變有無義突變(Nonsense mutation)、錯義突變(Missense mutation)和移碼突變(Frameshift mutation)3種類別。發(fā)生在非編碼區(qū)的突變和編碼區(qū)的同義突變又稱為沉默突變(Silent mutation),該類型突變不會改變蛋白質(zhì)翻譯。在所有遺傳變異類型中,錯義突變是人類遺傳變異中最常見的一類,根據(jù)錯義突變是否對人體產(chǎn)生危害,分為中性和非中性突變(即致病性突變)兩種類別[9]。圖1給出了單核苷酸變異的類型。

發(fā)生在編碼區(qū)的SNVs分為同義、無義、錯義和移碼突變4種類別,如圖2所示。

圖1 單核苷酸變異類型

圖2 編碼區(qū)的SNVs

(1)同義突變指編碼后的蛋白質(zhì)不發(fā)生改變。如圖2(a)所示,在編碼親水性絲氨酸(Serine,Ser)的密碼子TCA中,腺嘌呤(A)突變?yōu)轼B嘌呤(G)/胸腺嘧啶(T)/胞嘧啶(C),密碼子相應突變?yōu)門CG/TCT/TCC。由遺傳密碼矩陣可知,突變后的3種密碼子仍編碼為絲氨酸;

(2)無義突變又稱為終止獲得型突變,突變導致蛋白質(zhì)翻譯過程提前終止。如圖2(b)所示,在編碼谷氨酰胺(Glutamine,Glu)的密碼子CAG中,胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T),突變后的密碼子為TAG。由于TAG是一種終止密碼子,所以,突變導致蛋白質(zhì)翻譯過程提前終止;

(3)錯義突變是一種最常見的SNVs,突變后,編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變。如圖2(c)所示,在編碼堿性組氨酸(Histidine,His)的密碼子CAT中,胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?突變后的密碼子為TAT,編碼的氨基酸也相應突變?yōu)槭杷缘睦野彼?Tyrosine,Tyr);

(4)移碼突變是指單核苷酸的插入或刪除,導致密碼子移位。如圖2(d)所示,刪除密碼子CAT中的胞嘧啶(C),導致密碼子均產(chǎn)生一個移位,使得編碼的蛋白質(zhì)均發(fā)生改變。

2 研究現(xiàn)狀

近些年,隨著生物測序技術的發(fā)展,大量的nsSNVs數(shù)據(jù)庫為該領域研究人員提供了基礎數(shù)據(jù)來源[25-27],基于生物計算的技術被應用到nsSNVs致病性預測問題,并且涌現(xiàn)了大量相關研究工作[17-19]。根據(jù)使用特征的不同,可分為6種類別,分別是:(1)基于突變頻率的方法,如Mutation significance(MutSig)[28];(2)基于通路的方法,如HotNet2[29];(3)結合基因組和轉(zhuǎn)錄信息的方法,如Combined annotation dependent depletion(CADD)[30];(4)基于序列進化保守性的方法,如Sorting intolerant from tolerant(SIFT)[31];(5)基于序列和結構混合特征的方法,如Polymorphism phenotyping v2(PolyPhen-2)[32];(6)綜合評價類方法,如Consensus deleteriousness score(Condel)[33]。表1給出了6類nsSNVs致病性研究的代表性方法和對應網(wǎng)址。

表1 6類nsSNVs致病性研究的代表性方法和對應網(wǎng)址

2.1 基于突變頻率的方法

基于頻率的突變預測方法是早期癌癥驅(qū)動基因分析的常用方法,主要通過觀測突變頻率在中性樣本(非致病性突變樣本)和疾病樣本(致病性突變樣本)中的差異來進行判斷,最具代表性的有MutSig[28]和Oncodrive-fm[34]。

MutSig[28]通過分析基于背景突變率(Background mutation rate,BMR)的相對突變豐度、基因內(nèi)熱點突變聚類情況,以及突變是否發(fā)生在被保護區(qū)域等3個方面,來預測突變的危害性。MutSig[28]的改進版Mutation significance covariates(MutSigCV)[35],也將上述3個方面作為突變致病性判斷的核心因素。另外,MutSigCV將“聚類”和“保護”聯(lián)合計算,實現(xiàn)在保守熱點區(qū)域內(nèi)聚類,避免突變特性的重復計算[35]。在計算BMR時,MutSigCV發(fā)現(xiàn)鄰居(Neighbor)基因與中心基因具有相似的基因組特性,如脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)復制時間、染色質(zhì)狀態(tài)(開放/封閉)以及轉(zhuǎn)錄活性的一般水平(高轉(zhuǎn)錄與未轉(zhuǎn)錄)等;此外還發(fā)現(xiàn),類似基因組參數(shù)與背景突變率緊密相關,因此,MutSigCV將此類協(xié)變量納入背景模型,通過匯集協(xié)變量空間的鄰居基因數(shù)據(jù)來改善BMR估計,實驗結果證明,MutSigCV可明顯減少假陽性(False positive)數(shù)量[35]。

由于MutSig[28]和MutSigCV難以鑒別具有低復發(fā)頻率的驅(qū)動基因[11],Abel等人提出了Oncodrive-fm[34]方法,這是一種不依賴于突變復發(fā)的候選癌癥驅(qū)動基因檢測方法。該方法檢測多個腫瘤樣本,發(fā)現(xiàn)具有高功能影響(Functional impact,FI)趨勢的基因或模塊,與此同時,重點評估2個指標:(1)跨多個腫瘤樣本,評估所有基因的體細胞SNVs的FI值;(2)評估每個基因或基因模塊中FI變異的重要性[34]。因此,在檢測候選驅(qū)動基因或基因模塊時,Oncodrive-fm可以有效識別低復發(fā)性候選癌癥驅(qū)動因子。

在識別癌癥驅(qū)動基因中,MutSig[28]和Oncodrive-fm[34]均將基因作為基本單元,并假設基因是癌癥中具有特定作用的實體,Porta-Pardo等人認為針對不同區(qū)域的突變,對整個基因的影響可能并不相同,與癌癥的相關性也可能不盡相同;同一蛋白質(zhì)內(nèi)不同功能區(qū)域(Protein functional regions,PFR)在致癌機制中的作用也可能不同。針對上述問題,Porta-Pardo等人開發(fā)了e-Driver[36]。該方法通過識別一個蛋白質(zhì)不同PFR的體細胞錯義突變,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)中具有突變偏移的區(qū)域,包括域(Domains)或內(nèi)部無序區(qū)域(Intrinsically disordered regions,IDRs),解釋了具有突變偏移的蛋白質(zhì)可能是真正的癌癥驅(qū)動力[36]。

2.2 基于通路的方法

基于細胞信號傳導與調(diào)節(jié)通路的預測方法,在預測突變是否對人體健康產(chǎn)生危害時,通常會考慮突變的生物效應,即基因間的相互作用和已知的生物通路,代表性方法有Paradigm-Shift[37]和HotNet2[29]。

Sam等人指出,若焦點基因(Focus gene,FG)突變后導致功能喪失(Loss of function,LF),理論上會在轉(zhuǎn)錄后的表達水平有所體現(xiàn),即當檢查FG下游基因的活動時,可能會發(fā)現(xiàn)FG不活躍的證據(jù)。類似地,若FG發(fā)生功能獲得型突變(Gain of function mutation,GFM),理論上也會在調(diào)控通路的上下游有所表達[37]。基于該理論背景,Sam等人于2012年提出了Paradigm-Shift方法[37]。在一組通路相互作用的背景中,該方法使用置信傳播算法推斷基因表達活性和拷貝數(shù)情況,同時檢測其下游鄰域中基因的預期活性相對于其上游的預期差異,利用基因的已知遺傳相互作用,激活或失活這些相互作用的基因,從而判定突變是否導致蛋白質(zhì)功能喪失或獲得。該算法使用來自基因下游輸出的預測結果調(diào)節(jié)上游輸入,因此被認為能夠為突變注釋提供更準確的信息[37]。

Leiserson等人于2015年提出的HotNet2[29],使用“絕緣”熱擴散理論,對擴散網(wǎng)絡中的熱量來源進行編碼,分析基因突變及其局部拓撲結構,最終發(fā)現(xiàn)具有較高熱分數(shù)的“熱”子網(wǎng),鑒別出具有顯著突變相互作用的基因組。具體地,HotNet2對來自癌癥基因組圖譜(The cancer genome atlas,TCGA)的12種癌癥類型,共3 281個樣本,進行了突變網(wǎng)絡分析,鑒別出16個具有顯著突變的子網(wǎng)絡,其中包括眾所周知的癌癥信號傳導通路,以及在癌癥中具有較少特征作用的子網(wǎng)絡;此外,還發(fā)現(xiàn)在許多突變子網(wǎng)中,樣本突變表現(xiàn)出共發(fā)性,即子網(wǎng)的多個基因在多種癌癥中均具有體細胞(即非生殖性細胞)突變[29]。

2.3 結合基因組和轉(zhuǎn)錄信息的方法

結合基因組和轉(zhuǎn)錄信息的方法是利用大量數(shù)據(jù)庫中存放的人類遺傳變異數(shù)據(jù),多角度全面分析人類疾病(包括癌癥)與nsSNVs之間的相關性,揭示疾病的發(fā)病機理,進而加快推動有關疾病治療藥物的研發(fā),代表性方法有CADD[30]和Deleterious annotation of genetic variants using neutral networks(DANN)[38]。

Kircher 等人于2014年提出了CADD[30]方法,用以預測nsSNVs致病性。該方法不僅考慮了生物進化保守性特性,而且將轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)水平等信息納入變異數(shù)據(jù)特征表示中,使用C-score來衡量編碼區(qū)和非編碼區(qū)變異的有害程度;CADD的web server提供了基因組所有86億個可能SNVs的C-scores和indels評分等[39]。

Quang等人認為CADD[30]使用的支持向量機(Support vector machine,SVM)分類器無法捕獲特征間的非線性關系,限制了CADD預測性能的發(fā)揮。鑒于此,Quang等人于2015年對CADD進行了改進,使用與CADD相同的樣本數(shù)據(jù)和特征集合,訓練深度神經(jīng)網(wǎng)絡,提出了DANN[38],該網(wǎng)絡模型比SVM更適用于大樣本問題,能夠有效捕獲特征間的非線性關系。實驗結果表明,相比于CADD,DANN的錯誤率減少了19%,Area under the curve(AUC)增加了14%。

2.4 基于序列進化保守性的方法

基于序列進化保守性的方法,主要通過搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,獲得查詢序列的同源蛋白質(zhì)多序列比對結果,根據(jù)不同的計算準則,得到該查詢序列特定位置處的氨基酸進化保守性,代表性方法有SIFT[31]和Mutation Assessor[40]。

SIFT是通過計算序列中每個氨基酸殘基突變?yōu)槠渌愋偷目赡苄?并將序列劃分為保守區(qū)和非保守區(qū),在保守區(qū)的突變傾向于有害突變,在非保守區(qū)的突變傾向于中性突變[31]。SIFT不僅可以預測天然的錯義突變,還可以預測基于實驗室條件下的誘導突變[31]。2018年3月,在SIFT 的web server中,更新添加了SIFT for Genomes和indels預測工具[41]。

Reva等人認為進化保守模式,能夠有效地整合氨基酸殘基的任何突變影響信息[40],他們開發(fā)的Mutation Assessor[40]將序列比對結果進行聚類,然后將聚類結果轉(zhuǎn)化為同源序列中家族和亞家族的保守模式,使用組合熵測量其家族及亞家族中氨基酸殘基的進化保守性。他們認為在任何種類保守模式中的殘基發(fā)生突變,都有可能影響蛋白質(zhì)功能[40]。

PROVEAN[18]也是一種利用多序列比對預測蛋白質(zhì)中單個或多個氨基酸突變危害性的方法。與Mutation Assessor[40]與SIFT[31]不同的是,PROVEAN不僅計算感興趣位置的氨基酸殘基,而且衡量鄰近側翼序列的比對質(zhì)量,使用基于區(qū)域的δ比對評分(Delta alignment score,DAS)來預測突變是否對人體產(chǎn)生危害[18]。在2015年1月的更新中,PROVEAN預測了Ensembl v66人類蛋白質(zhì)中所有可能的SNVs和indels[42]。

已有的非編碼區(qū)突變預測工具CADD[30]與FATHMM-MKL[43],本地運行均需要大量預先計算的信息[44],為了簡化計算,便于預測,Capriotti等人于2017年開發(fā)PhD-SNPg[44],僅使用基于序列特征(25個來自于序列編碼,10個來自于PhyloP[45]的保守分值),以0到1之間的概率值作為預測輸出,大于0.5則認為突變對人體是有害的。

2.5 基于序列和結構混合特征的方法

蛋白質(zhì)功能和疾病之間的關系錯綜復雜,當目標蛋白質(zhì)與環(huán)境分子之間有復雜相互作用時,僅依靠統(tǒng)計數(shù)據(jù)和進化統(tǒng)計分析,預測方法的性能往往受到限制[11]。目前更多的方法是基于序列和結構混合特征進行預測,該類方法通常與機器學習相結合。即利用從序列和結構中獲取的特征,訓練機器學習分類器模型,預測變異是否對人體產(chǎn)生危害。代表性方法有PolyPhen-2[32]和Functional analysis through hidden Markov models v2.3(FATHMM)[46]。

PolyPhen-2[32]除使用傳統(tǒng)特征外,還計算了蛋白質(zhì)氨基酸殘基接觸信息,如與雜原子接觸(Contacts with heteroatoms),鏈間接觸(Interchain contacts)以及與功能位點接觸(如BINDING、ACT_SITE、LIPID以及METAL等),PolyPhen-2將這些功能屬性作為突變數(shù)據(jù)的特征標識,使用Na?ve Bayes模型進行預測[32]。在預測錯義突變時,其輸出結果與幾種常見的預測方法不同,SIFT[31],PROVEAN[18]和FATHMM[47]的預測結果為“Neutral”和“Deleterious”兩種類別,而PolyPhen-2預測包括“benign”、“possibly damaging”和“probably damaging”等3種結果[32]。

FATHMM[46]利用隱馬爾可夫模型(Hidden Markov models,HMM)計算序列的保守性,預測蛋白質(zhì)錯義突變的功能效應。它不僅可以預測編碼區(qū)的nsSNVs,還可以對非編碼變異(Non-coding variants,ncV)進行預測[46]。在FATHMM的nsSNVs致病性預測工具中,包括基于序列保守的加權和未加權兩種類別,其中加權算法加入了序列保守性和致病性權重,可以解釋序列對變異的耐受性[47]。

CRAVAT[48]、VEST[49]以及SNAP[50]也是基于序列和結構混合特征的nsSNVs致病性預測方法。已有研究表明,nsSNVs的危害性與其周邊的微環(huán)境息息相關[51,52]。CRAVAT[48]和VEST[49]將變異的序列微環(huán)境和局部蛋白質(zhì)結構性質(zhì),作為樣本數(shù)據(jù)的特征標識,即提取氨基酸殘基的物理化學性質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA多序列比對得分、基于區(qū)域的氨基酸序列組成、預測的局部蛋白質(zhì)結構性質(zhì)等86個特征,再使用機器學習分類器進行預測[48,49]。SNAP[50]通過計算基于多序列比對的進化保守性得分,結合蛋白質(zhì)三維結構信息,使用神經(jīng)網(wǎng)絡模型來預測蛋白質(zhì)序列中的突變,并將預測結果轉(zhuǎn)化為0(Neutral,中性突變)和1(Deleterious,有害突變)兩種類別[50]。

2.6 綜合評價類方法

綜合評價類方法利用多個nsSNVs致病性預測工具的輸出結果,設定綜合評價得分準則,結合機器學習技術,預測nsSNVs的致病性。綜合評價類方法的預測結果通常優(yōu)于單一預測工具[12,53],代表性方法有Condel[33]和PredictSNP1[12]。

Condel[33]最初整合了5種預測工具(即SIFT[31]、Polyphen-2[32]、MAPP[54]、LogR Pfam E-value[55]和Mutation Assessor[40])的輸出結果,通過加權平均計算共有的有害性評分,并將其作為nsSNVs致病性預測的依據(jù)。在Condel最近一次更新中,確定Mutation Assessor[40]和 FATHMM[47]組合能夠得到的預測結果。在Condel的web server中,提供了預先計算的人類蛋白質(zhì)全部編碼基因的5種工具(Condel[33]、SIFT[31]、PolyPhen-2[32]、Mutation Assessor[40]以及FATHMM[47])的預測結果。

與Condel[33]類似,TransFIC[47]也是一種轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)突變功能影響評分的預測工具。TransFIC[47]整合SIFT[31]、Polyphen-2[32]和Mutation Assessor[40]的預測得分,將該分數(shù)與種系中具有相似功能注釋的基因SNVs的分數(shù)分布進行比較,并使用Z-score來轉(zhuǎn)換得分,結果表明,對種系SNVs耐受性較差的基因突變得分被增大,相對耐受較好的基因突變得分被降低[47]。TransFIC[47]的預測結果能夠提供TransFIC得分、基于SIFT的TFIC_SIFT得分、基于PolyPhen-2的TFIC_PPH2得分以及基于Mutation Assessor的TFIC_MA得分。與整合的3種預測工具相對應,TransFIC還給出3種輸出標簽:TFIC_SIFT_LABEL、TFIC_PPH2_LABEL和TFIC_MA_LABEL。經(jīng)過轉(zhuǎn)換后,TransFIC最終用0、1和2代表突變的3種危害程度(Low、Medium和High),分值越大,突變的危害性越大[47]。

PredictSNP1[12]對8種已有的預測工具(MAPP[54]、nsSNPAnalyzer[56]、PANTHER[57]、PhD-SNP[58]、PolyPhen-1[59]、PolyPhen-2[32]、SIFT[31]和SNAP[50])進行無偏估計,并將上述8種預測工具中表現(xiàn)最佳的6種工具,組合成一致性分類器PredictSNP1,其web server提供了上述9種工具的預測結果。

PredictSNP2[60]構建了覆蓋不同類別(包括Regulatory、Splicing、Missense、Synonymous和Nonsense variants)的疾病相關變異預測模型,綜合了6種工具(CADD[30]、DANN[38]、FATHMM[43]、FitCons[61]、FunSeq2[62]和GWAVA[63])的預測結果,將表現(xiàn)最好的5種工具的輸出結果,轉(zhuǎn)化為PredictSNP2共識評分,其web server提供了上述7種工具的預測得分。

REVEL[53]集成了13種預測方法(MutPred[64]、FATHMM v2.3[47]、VEST 3.0[65]、PolyPhen-2[32]、SIFT[19]、PROVEAN[18]、Mutation Assessor[40]、Mutation Taster[66]、LRT[67]、GERP++[68]、SiPhy[69]、phyloP[45]和phastCons[70])的輸出結果。REVEL[53]實驗結果表明,其優(yōu)于上述13種單一預測方法,同時也優(yōu)于7種類似的集成預測方法(MetaSVM[71]、MetaLR[71]、KGGSeq[72]、Condel[33]、CADD v1.3[30]、DANN[38]和Eigen[73])。

3 常見的SNVs數(shù)據(jù)庫

全世界范圍內(nèi),大量SNVs數(shù)據(jù)庫存儲了多態(tài)性變異、致病性變異、致癌性突變、與癌癥有因果關系的突變基因目錄、專家策劃的體細胞突變等數(shù)據(jù)。在nsSNVs致病性預測研究中,這些數(shù)據(jù)庫經(jīng)常被使用到,下面對6種常見的數(shù)據(jù)庫進行詳細介紹。

3.1 intOGen

2018年,Tamborero D等人將已識別的癌癥驅(qū)動基因,基因測序技術和臨床藥物反應3者結合,建立了癌癥基因組解釋器(Cancer genome interpreter,CGI)[74]。CGI不僅可以識別新測序腫瘤的所有已知和可能的致癌基因組突變(包括單點突變、短插入/刪除、拷貝數(shù)改變和/或基因融合),評估未知意義變體,而且還能注釋腫瘤的所有變體,這些變體將構成使用不同臨床藥物反應的最新生物標志物[74]。

BBGLab使用CGI工具,開發(fā)了腫瘤基因組學數(shù)據(jù)庫Integrative onco genomics(intOGen,https://www.intogen.org/search)[75],通過分析66種腫瘤類型,發(fā)現(xiàn)并存儲了568個癌癥驅(qū)動基因(Cancer driver gene,CDG)。用戶可通過網(wǎng)站查詢某個基因在特定癌癥中的突變信息(如某種癌癥驅(qū)動基因或突變頻率等),此外,用戶還可以下載全部癌癥驅(qū)動基因數(shù)據(jù)[75]。

3.2 COSMIC

癌癥中的體細胞突變目錄數(shù)據(jù)庫(Catalogue of somatic mutations in cancer,COSMIC,https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)[76],是一個探索體細胞突變對人類癌癥影響最大、最全的數(shù)據(jù)庫。它由4個不同子項目組成,每個項目呈現(xiàn)出一個單獨的數(shù)據(jù)集或視圖,具體包括:(1)專家策劃的體細胞突變數(shù)據(jù)庫COSMIC;(2)超過1 000種用于癌癥研究的細胞系突變譜Cell lines project;(3)基于三維結構的癌癥突變交互式視圖COSMIC-3D[77];(4)具有與癌癥有因果關系的突變基因目錄Cancer gene census[76]。COSMIC中可以查詢基因突變、癌癥驅(qū)動基因等信息,同時提供數(shù)據(jù)下載功能,可下載數(shù)據(jù)包括:所有基因突變數(shù)據(jù)、基因普查數(shù)據(jù)及相應突變、拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)、非編碼區(qū)突變數(shù)據(jù)以及COSMIC所有基因的fasta格式數(shù)據(jù)等[76]。

3.3 CanProVar 2.0

以fasta格式存儲的人類癌癥蛋白質(zhì)組變異數(shù)據(jù)庫(Human cancer proteome variation database,CanProVar2.0,http://canprovar2.zhang-lab.org/datadownload.php)[3],將變異信息顯示在每條記錄的頭部:“rs”表示變異呈現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP),“cs”表示突變與癌癥相關(Cancer related mutations,CAM)。在CanProVar 2.0中,共記錄了967 017個SNP和156 671個CAM。此外,該數(shù)據(jù)庫按照癌癥類型劃分為41子單元,如腦癌(含327個突變)、食道癌(含2 246個突變)、腎上腺腫瘤(含15個突變)等[3]。

3.4 humsavar

人類多態(tài)性與疾病突變(Human polymorphisms and disease mutations,humsavar,https://www.uniprot.org/docs/humsavar)數(shù)據(jù)庫[26]中列出了人類UniProtKB/Swiss-Prot[78]中注釋的所有錯義突變,存儲了31 132個與疾病(Disease)相關突變,39 464個多態(tài)性(Polymorphism)變異,以及8 383個未標記(Unclassified)變異。值得注意的是,該數(shù)據(jù)庫提供的變異分類僅用于科學研究,而不用于臨床和疾病診斷。

3.5 ClinVar

Clinical variants(ClinVar,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)[25]匯總了來自National Coalition Building Institute(NCBI)的基因組變異,以及這些變異與人類健康間關系的數(shù)據(jù)庫。在ClinVar的搜索欄輸入cancer,可以得到數(shù)據(jù)庫中關于癌癥的突變分類結果,如針對臨床意義,變異分為良性、可能良性、可能致病、不確定意義等7種類別;針對變異對分子產(chǎn)生的后果,可分為移碼、錯義、拼接、非編碼RNA等7種類別;針對變異類型,又包括刪除、復制、插入/刪除、單核苷酸變異等;除此之外,ClinVar還提供包括變異長度、審核狀態(tài)、等位基因起源、變異基因關系等角度的突變分類結果數(shù)據(jù)[25]。

3.6 1 000 Genomes

1000人基因組計劃1000 Genomes(http://browser.1000genomes.org)包括了1 000個人(來自于26個人種)的全部基因組數(shù)據(jù),以及從數(shù)據(jù)庫的基因組覆蓋率和靶向測序中發(fā)現(xiàn)的變異信息[79]。用戶通過專用的瀏覽器(1000 genomes browser),可在基因組注釋的背景下查看1 000個人基因組數(shù)據(jù),如蛋白質(zhì)編碼基因,全基因組調(diào)控信息等。1000 genomes browser中還包括所有非同義突變效應預測器(Variant effect predictor,VEP)[80]、SIFT[31]和PolyPhen[32]預測結果。

4 nsSNVs致病性預測常用的特征表示方法

常見的nsSNVs致病性預測方法中,基于序列特征的預測方法有CHASM[81]、PROVEAN[18]、FATHMM[47]、Mutation Assessor[40]和PANTHER[57];基于結構特征的預測方法有SDM[82]和APOGEE[83];目前更多的方法是基于序列和結構混合特征進行預測的,如SNAP[50]、PolyPhen-2[32]和iFish[84];另外,綜合評價類方法的特征來自于已有預測方法的輸出結果,如Condel[33]、PredictSNP1[12]和REVEL[53]。借鑒上述預測方法所使用的特征,將突變的常用特征表示分為4種類別:(1)基于蛋白質(zhì)序列的特征;(2)基于蛋白質(zhì)結構的特征;(3)突變位點微環(huán)境特征;(4)基于已有預測工具輸出的特征。4類特征表示方法可歸納如下。

4.1 基于蛋白質(zhì)序列的特征

4.1.1 位置特異性得分矩陣

人類nsSNVs是否對人體產(chǎn)生危害,與生物進化過程息息相關。在蛋白質(zhì)相關研究中,位置特異性得分矩陣(Position specific scoring matrix,PSSM)包含了非常重要的生物進化信息,已被證明是一種非常有效的特征[85,86]。通常使用Position-specific iterated basic local alignment search tool(PSI-BLAST)[87]工具,搜索Swiss-Port[88]數(shù)據(jù)庫,為輸入的待查詢蛋白質(zhì)序列構建同源蛋白質(zhì)多序列比對(Multiple sequence alignment,MSA),在MSA的基礎上計算PSSM信息。

4.1.2 功能位點突變

已有研究表明,突變是否發(fā)生在重要功能位點,對突變后蛋白質(zhì)功能能否正常發(fā)揮有較大影響[32,89]。例如,SAPRED[89]通過查詢Swiss-Prot[88]數(shù)據(jù)庫,確定突變是否發(fā)生在被注釋為ACT_SITE以及METAL等功能位點;PolyPhen-2[32]通過查詢蛋白質(zhì)UniProtKB/Swiss-Prot[78]數(shù)據(jù)庫,確定突變是否發(fā)生在DISULFID、SIGNAL、BINDING以及ACT_SITE等重要功能位點。在nsSNVs致病性預測研究中,尤其是蛋白質(zhì)SNVs的研究中,通常會將突變是否發(fā)生在活性位點(Active sites)、結合位點(Binding sites)以及非球狀區(qū)視為特征的重要組成部分。

4.1.3 突變點位性質(zhì)

(1)物理化學/生物化學性質(zhì)。在nsSNVs致病性預測研究中,許多文獻將蛋白質(zhì)突變位點的物理化學/生物化學性質(zhì)作為特征的重要組成部分,如突變前后氨基酸親水性(Hydrophilicity)、疏水性(Hydrophobicity)、體積(Volume)、分子量(Molecular weight)、電極性(Polarity)等屬性值以及突變前后變化值[2,11,90]。

氨基酸的物理化學/生物化學屬性值可通過氨基酸索引數(shù)據(jù)庫(Amino acid index database,AAindex,https://www.genome.jp/aaindex/)[91]查詢得到。AAindex[91]是一個數(shù)字索引數(shù)據(jù)庫,代表氨基酸和氨基酸對的各種物理化學和生物化學特性,所有數(shù)據(jù)均來自于已發(fā)表文獻;它由AAindex1(代表20個數(shù)值的氨基酸索引)、AAindex2(代表氨基酸突變矩陣)和AAindex3(代表統(tǒng)計蛋白質(zhì)接觸電位)等3個部分組成。在最近更新的版本(v9.2,Feb 2017 Released)中,AAindex1共存儲了566種氨基酸指標。

(2)替換打分矩陣BLOSUM和PAM。BLOSUM[92]和PAM[93]是蛋白質(zhì)序列比對的替換打分矩陣,用于計算任意兩條序列的相似性,發(fā)現(xiàn)兩者的生物進化關系,進而有效地分析和預測基因功能。例如,使用PSI-BLAST[87]計算PSSM信息時,默認的替換打分矩陣是BLOSUM62[92]。在nsSNVs致病性預測研究中,通過查詢此兩類矩陣,可以得到突變氨基酸對的替換打分值,并將其歸為突變樣本的特征組成部分。

4.2 基于蛋白質(zhì)結構的特征

基于蛋白質(zhì)結構的特征分為兩類:(1)蛋白質(zhì)在Protein data bank(PDB)[94]中有已知的三級結構,可直接提取結構信息;(2)蛋白質(zhì)三級結構未知,但可通過計算機軟件模擬的方式得到蛋白質(zhì)結構信息。

4.2.1 蛋白質(zhì)三級結構已知

若蛋白質(zhì)在PDB[94]中存在已知的三級結構,則可利用Dictionary of secondary structure in proteins(DSSP)[95]、Biopython中的The PDB Module[96]等工具,獲得關于突變位點的二級結構(Secondary structure,SS)、溶劑可及表面積(Solvent accessible surface area,SASA)、無序區(qū)域(Disorder region,DR)、Phi-Psi二面角、原子的空間坐標(Atomic spatial coordinates)等結構信息[94],并將這些信息作為突變樣本的特征組成部分。

4.2.2 蛋白質(zhì)三級結構未知

對于三級結構未知的蛋白質(zhì),可通過計算軟件預測的方式獲取結構信息,并將這些預測信息納入突變樣本的特征表示中,豐富特征的同時,以期提高nsSNVs致病性預測的準確度。以下是幾類常見的結構信息預測方法。

(1)蛋白質(zhì)三維結構預測。由Zhang Lab研發(fā)的Iterative threading assembly refinement(I-TASSER)[97]和QUARK[98]是全球領先的蛋白質(zhì)三級結構預測工具。截至2020年9月25日,已有來自149個國家的136 217個使用者,利用I-TASSER的web server預測了571 261個蛋白質(zhì)的結構。I-TASSER[97]的返回結果包括預測的二級結構及對應得分、預測的溶劑可及性面積、預測的標準化B因子、I-TASSER使用的前10個threading模板以及預測的Top 5模型等信息[99]。在nsSNVs致病性預測研究中,可以提取I-TASSER預測的部分相關結構信息,將其作為突變樣本的特征組成部分。

(2)相對溶劑可及性預測。已經(jīng)有多種方法可以用于預測蛋白質(zhì)的相對溶劑性(Relative solvent accessibility)。SANN[100]是此類方法的一個代表,它為蛋白質(zhì)序列中每個氨基酸殘基提供3種概率值,即分別屬于埋藏(Buried)、中間(Intermediate)和暴露(Exposed)的概率值[100]。

(3)二級結構預測。預測得到的二級結構(Predicted secondary structure,PSS)亦是一類非常有效的結構特征[101,102],可以通過PSIPRED[103]工具預測獲得。該工具為蛋白質(zhì)序列中的每個氨基酸殘基提供3個概率值,即分別屬于Coil(C)、Helix(H)和Strand(S)的概率值[103]。

(4)無序區(qū)域預測。蛋白質(zhì)的無序區(qū)域(Disorder)是指不具有固定的三級結構,部分或完全展開的區(qū)域。該區(qū)域被認為參與許多重要功能,如DNA識別、特異性調(diào)節(jié)等[104]。已有研究表明,在無序區(qū)域中發(fā)生的突變,會對蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響[105]。蛋白質(zhì)的無序區(qū)域可通過DISOPRED[106]等多種軟件預測得到。

4.3 突變位點微環(huán)境特征

突變位點的微環(huán)境,可以由基于蛋白質(zhì)三維結構的“鄰居”(與突變位點空間距離小于特定?范圍)氨基酸殘基構成,也可以由基于蛋白質(zhì)序列的“鄰居”(與突變位點在序列上小于特定長度范圍)氨基酸殘基構成[94]。文獻研究結果表明,單個氨基酸殘基突變是否有害,通常與其微環(huán)境中氨基酸殘基相關[51,52,89]。因此,在包括nsSNVs致病性預測在內(nèi)的蛋白質(zhì)相關研究中,通常會提取微環(huán)境范圍內(nèi)信息,并將其作為待研究問題的特征組成部分,以期豐富特征表示,提高預測性能[107]。在提取微環(huán)境特征時,滑動窗口大小的確定是至關重要的一步[108]。

4.4 基于已有預測工具輸出的特征

綜合評價類工具Condel[33]、TransFIC[47]、PredictSNP1[12]、PredictSNP2[60]和REVEL[70]的web server提供了多種工具的突變預測結果。例如,Condel[33]提供了預先計算的所有人類蛋白質(zhì)編碼基因中全部可能變異的Condel[33]、SIFT[31]、PolyPhen-2[32]、Mutation Assessor[40]和FATHMM[46]5種預測得分[47];TransFIC[47]提供突變數(shù)據(jù)的TransFIC、TFIC_SIFT、TFIC_PPH2以及TFIC_MA 4種預測得分[47];PredictSNP1[12]提供突變數(shù)據(jù)的MAPP[54]、nsSNPAnalyzer[56]、PANTHER[57]、SIFT[31]以及SNAP[50]等9種預測得分。借鑒綜合評價類方法的思想,將已有工具的預測得分,作為突變樣本的特征表示,連同提取的其它特征,設定綜合評價得分準則,結合機器學習技術,對nsSNVs的致病性進行預測。

5 突變預測結果評價

混淆矩陣(Confusion matrix)由真陽性(True positive,TP)、真陰性(True negative,TN)、假陽性(False positive,FP)和假陰性(False negative,FN)組成。基于上述4個值,衍生出一系列評價指標,如準確度(Accuracy,ACC)[109]、馬修斯相關系數(shù)(Matthews correlation coefficient,MCC)等[110,111]。ACC是預測正確的樣本數(shù)(包括真陽性和真陰性)占所有樣本數(shù)的比例。當正負樣本數(shù)量嚴重不均衡時,MCC被認為是衡量混淆矩陣的最佳指標,其取值范圍是-1到1,其中1表示預測值與真值完全相同,0表示預測結果隨機,-1表示完全相反。通常,MCC的值越大,分類效果越好。具體公式如下

(1)

(2)

除ACC和MCC之外,Receiver operating characteristic(ROC)和AUC也是重要的分類效果評價指標。ROC曲線的x軸是假陽性率(False positive rate,FPR),表示預測為假陽性樣本數(shù)占所有真陰性樣本數(shù)的比例,y軸是真陽性率(True positive rate,TPR),表示預測為真陽性樣本數(shù)占所有陽性樣本的比例,這是兩個相互獨立的統(tǒng)計量。對于一個預測結果為概率值的分類器,可以設置若干個閾值θ,每個θ對應一組(FPR,TPR),由此繪制ROC曲線[112]。ROC曲線越接近左上角,表示分類效果越好。AUC是ROC曲線下的面積,通常認為面積越大,分類效果越好[113]。

6 12種常見nsSNVs致病性預測方法比較

機器學習技術在蛋白質(zhì)相關研究領域有著廣泛的應用,如蛋白質(zhì)配體綁定預測[107,114]、跨膜蛋白預測等[115,116]、DNA配體綁定位點預測[117]、蛋白質(zhì)三級結構預測[118]、蛋白質(zhì)殘基接觸圖預測[119]、nsSNVs致病性預測[32,43]等。表2列出了12種常見的nsSNVs致病性預測方法的比較結果。分析表2中的數(shù)據(jù),可以得到如下結論。

表2 12種常見nsSNVs致病性預測方法的比較(數(shù)據(jù)來自于文獻[1])

(1)經(jīng)典預測工具SIFT[31]、PROVEAN[18]、PolyPhen-2[32]和CADD[18]具有較高的MCC。其中,SIFT[31]和PROVEAN[18]是基于序列進化保守性的方法,構建查詢序列的同源蛋白質(zhì)多序列對比是其核心思想。PolyPhen-2[32]將提取的序列和結構混合特征作為輸入,訓練Na?ve Bayes模型,最終的錯義突變預測結果包括“benign”、“possibly damaging”和“probably damaging”等3種類別,這與只有2類別預測結果的方法(SIFT[31]、PROVEAN[18]、Mutation Assessor[40]等)有較大不同。CADD[18]為每個變異提取了949個特征,使用SVM分類器來捕獲變異特征間的線性關系,對變異有害性進行預測。

(2)REVEL[53]和DANN[38]具有較高的AUC。REVEL[53]是一種綜合評價類工具,它集成了13種單一預測方法的輸出結果,其預測性能優(yōu)于13種單一預測工具,同時也優(yōu)于其它7種類似的綜合評價類預測方法[53]。DANN[38]使用了與CADD[18]相同的數(shù)據(jù)集和特征,研究結果表明,基于深度學習框架的DANN[38]能更有效地捕獲特征間的非線性關系。

(3)總結相關文獻,發(fā)現(xiàn)隨機森林決策樹(Random forest,RF),SVM以及基于Voting的機器學習方法,在不同基準數(shù)據(jù)集的變異預測方面均表現(xiàn)出較優(yōu)秀的預測效果[1]。

7 結束語

隨著nsSNVs對人類健康影響研究的快速開展,截至2020年9月,intOgen記錄了66種癌癥的203 003 820個突變信息[75];COSMIC的癌癥基因普查數(shù)據(jù)庫中記錄的致癌基因共723個[76];CanProVar 2.0中記錄了156 671個蛋白質(zhì)SNVs與癌癥相關[3];humsavar中記錄了39 464個呈現(xiàn)多態(tài)性的nsSNVs[26]。

該文對nsSNVs致病性預測的5個方面進行了概述,包括nsSNVs變異類別、致病性預測方法、常見SNVs數(shù)據(jù)庫、特征表示和常見nsSNVs致病性預測方法比較。在致病性預測方法分類方面,根據(jù)方法所使用特征的不同,將本領域的國內(nèi)外研究歸納為6大類別:基于突變頻率的方法需要大量的先驗知識,主要根據(jù)突變頻率在中性和致病性樣本間的差異進行預測,但此類方法難以鑒別具有低復發(fā)頻率的驅(qū)動基因;基于通路的方法考慮突變基因間的相互作用關系網(wǎng)絡以及生物效應,是一類非常有效的驅(qū)動突變預測方法;結合基因組和轉(zhuǎn)錄信息的方法充分利用了人類基因組測序得到的數(shù)據(jù),能夠更全面地解釋疾病發(fā)病機理;基于序列進化保守性,以及基于序列和結構混合特征的預測方法是較為常見的,代表性方法有SIFT[31]和PolyPhen-2[32]等;綜合評價類方法是根據(jù)若干已有預測工具的輸出,制定打分準則,綜合評價,此類方法的效果往往優(yōu)于單一預測工具。

盡管目前進行了很多nsSNVs致病性預測研究,但快速準確地預測突變是否會導致疾病(或癌癥),仍是一項非常具有挑戰(zhàn)性的工作,以下幾個方面可能是潛在的研究突破點。

(1)基于全基因組數(shù)據(jù)的預測。從DNA微陣列技術測得信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)的表達豐度,到轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路,蛋白質(zhì)翻譯,再到染色體結構,從這一系列過程中,發(fā)現(xiàn)突變的根源,挖掘基因突變在后續(xù)轉(zhuǎn)錄、調(diào)控、翻譯等過程的系列影響,揭示突變對蛋白質(zhì)功能效應的影響機制,加快尋找致癌性突變的靶向藥物。

(2)深度學習框架的引入。人類基因組數(shù)據(jù)龐大,需要綜合考慮的因素錯綜復雜,數(shù)據(jù)樣本通常以萬為單位計量,深度學習框架或許能夠解決數(shù)據(jù)量大,同時滿足預測準確率高的要求。

(3)更多臨床實時數(shù)據(jù)的加入。癌癥驅(qū)動基因的預測和發(fā)現(xiàn),對指導癌癥臨床的早期診斷和藥物靶向治療有著重大意義;與此同時,臨床癌癥樣本、藥物反應等實時數(shù)據(jù),對理論研究也有較大的推動作用。