大口黑鱸維氏氣單胞菌的分離鑒定及其感染的病理?yè)p傷

鄧龍君

(雅礱江流域水電開(kāi)發(fā)有限公司，四川 成都 610051)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，廣泛分布于自然界中，有溫和型(A.veroniibiovarsobria)和維羅納型(A.veroniibiovarveronii)2個(gè)生物型[1]，是一種可引起人、獸和水生生物共患的革蘭氏陰性病原菌?，F(xiàn)已證實(shí)，維氏氣單胞菌可感染草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)[2]、中華鱘(Acipensersinensis)[3]、西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)[4]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[5]、花斑副沙鰍(ParabotiafasciataDabry)[6]、鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)[7]、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[8]、湘華鯪(SinilabeodecorusTungting)[9]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[10]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[12]和大鯢(Andriasdavidianus)[13]等數(shù)十種海淡水魚(yú)蝦蟹類和兩棲動(dòng)物類水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，常引起出血、腹水和潰瘍等癥狀，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人食用了被維氏氣單胞菌污染的水產(chǎn)品后，可引起胃腸炎和敗血癥等，甚至可導(dǎo)致免疫力低下者死亡[14]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)隸屬鱸形目(Perciformes)太陽(yáng)魚(yú)科(Centrachidae)黑鱸屬(Micropterus)，原產(chǎn)于北美洲密西西比河水系，具有抗逆性強(qiáng)、適溫性廣、生長(zhǎng)迅速、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，加之肉質(zhì)鮮美、無(wú)肌間刺等特點(diǎn)[15]，備受消費(fèi)者青睞。自1983年引入我國(guó)以來(lái)，經(jīng)多年人工養(yǎng)殖技術(shù)攻關(guān)與配合飼料的突破應(yīng)用，大口黑鱸在我國(guó)南起廣東、西至新疆、北達(dá)黑龍江等多個(gè)省份都有規(guī)模化養(yǎng)殖，并逐漸形成了繁育供苗、商品魚(yú)養(yǎng)殖、飼料生產(chǎn)和食品加工等較為完善的產(chǎn)業(yè)鏈，已成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖中最具前景的名優(yōu)品種之一。隨著養(yǎng)殖密度的不斷增加、水體環(huán)境的惡化以及病原微生物的滋生傳播，有關(guān)大口黑鱸疾病的報(bào)道日益增長(zhǎng)。2019年9月，四川省某養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的大口黑鱸發(fā)生以體表潰瘍?yōu)樘卣鞯募膊?，造成大量死亡。為明確其病因，對(duì)患病大口黑鱸進(jìn)行病原菌分離鑒定，觀察組織病理變化探究致病機(jī)制，藥物敏感性試驗(yàn)篩選敏感藥物，以期為大口黑鱸維氏氣單胞菌病的科學(xué)診斷和有效防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

患病大口黑鱸，體質(zhì)量150 g左右，采自四川省某養(yǎng)殖場(chǎng)；健康大口黑鱸，體質(zhì)量180 g左右，購(gòu)自四川省新津縣某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

腦心浸液瓊脂(Brain heart infusion,BHI)購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；MH培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；TaqDNA聚合酶和DNA Marker (DL2 000)購(gòu)自TaKaRa公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 剖解特征與組織病理學(xué)觀察

剖解病魚(yú)，觀察各組織器官的病理?yè)p傷情況，并取鰓絲、鰭條及體表黏液進(jìn)行寄生蟲(chóng)檢查。同時(shí)取患病魚(yú)的肝臟、脾臟、腎臟、腸、鰓和肌肉等組織，經(jīng)福爾馬林固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織損傷并拍照。

1.4 病原菌的分離與形態(tài)特征觀察

在無(wú)菌條件下，從患病大口黑鱸的肝臟、脾臟、腎臟等組織取樣，劃線接種至BHI培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)、分布及一致性，然后挑取形狀、大小、顏色均勻一致的優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落再次接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察菌落與細(xì)菌形態(tài)特征。純化后的菌株于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離菌株生理生化特性及藥敏試驗(yàn)

分離菌株的生理生化特性采用微量生化法測(cè)定，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行。藥物敏感性試驗(yàn)采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定。將分離菌株的單個(gè)菌落接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)至1.5×108cfu/mL。將新鮮菌液用無(wú)菌棉簽均勻涂布于MH平板，并貼上藥敏紙片28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈的直徑并判定敏感度。敏感度根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.6 分離菌株16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

取新鮮菌液于12 000 r/min離心2 min，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA。采用16S rRNA的通用引物[17]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共34次循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)公司測(cè)序。將分離菌株的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有氣單胞菌屬的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用DNA Star軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用MEGA 7.1軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 人工感染試驗(yàn)

將分離菌株接種于LB肉湯，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度至1.5×109、1.5×108、1.5×107、1.5×106C、1.5×105cfu/mL。健康大口黑鱸在水溫(28±2) ℃中暫養(yǎng)7 d后，腹腔注射菌液0.2 mL/尾，每組10尾；對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。接種后每隔24 h觀察大口黑鱸的臨床表現(xiàn)并統(tǒng)計(jì)死亡情況，連續(xù)觀察14 d。對(duì)感染后的病死魚(yú)及時(shí)進(jìn)行解剖，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚(yú)臨床癥狀與剖解特征

發(fā)病的大口黑鱸臨床癥狀主要表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢，食欲降低，甚至不攝食。病魚(yú)背部或體側(cè)出現(xiàn)潰瘍，并伴有水霉著生(圖1A、B)。剖檢發(fā)現(xiàn)，部分病魚(yú)鰓絲充血、出血，呈深紅色(圖1C)；肝臟腫大，呈淡黃色或土黃色(圖1D、E)；脾臟、腎臟腫大(圖1E、F)，呈暗紅色。鰓絲和體表黏液壓片鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)。

2.2 病原菌分離及形態(tài)觀察

從發(fā)病大口黑鱸的肝臟、脾臟、腎臟內(nèi)分離獲得1株優(yōu)勢(shì)菌株(編號(hào)為MYLY01)，28 ℃培養(yǎng)24 h后，在LB培養(yǎng)基上形成表面光滑，中央突起，邊緣完整，直徑1～2 mm的白色圓形菌落。經(jīng)革蘭氏染色，分離菌株為兩端鈍圓，多數(shù)單個(gè)排列，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢的革蘭氏陰性短桿菌(圖2)。

2.3 分離菌生理生化特性及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的主要生理生化特性見(jiàn)表1。由表1可知，分離菌株與維氏氣單胞菌的生理生化特性基本一致，初步判定其為A.veronii。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢呋辛、頭孢他啶、多黏菌素B、新霉素、頭孢噻呋鈉、大觀霉素、頭孢拉啶、慶大霉素8種藥物敏感；對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、卡那霉素、阿莫西林、妥布霉素、多西環(huán)素、萬(wàn)古霉素、羅紅霉素、克林霉素9種藥物耐藥(表2)。

2.4 分離菌人工感染試驗(yàn)結(jié)果

菌液濃度為1.5×109、1.5×108、1.5×107、1.5×106cfu/mL試驗(yàn)組的大口黑鱸在攻毒后第1天就表現(xiàn)出游動(dòng)緩慢無(wú)力，鰭條出血等癥狀，第3天開(kāi)始出現(xiàn)死亡；1.5×105cfu/mL試驗(yàn)組在攻毒后也出現(xiàn)不適反應(yīng)，但未見(jiàn)死亡；整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組大口黑鱸未見(jiàn)異常。隨著病情的發(fā)展，發(fā)病大口黑鱸的體表開(kāi)始出現(xiàn)局部潰爛的典型癥狀。到試驗(yàn)期結(jié)束，各試驗(yàn)組死亡率分別為 100%、60%、30%、10%、0%。根據(jù)寇氏法計(jì)算可得分離菌株對(duì)健康大口黑鱸的LD50為4.79×108cfu/mL。對(duì)人工感染發(fā)病的大口黑鱸體內(nèi)再次分離細(xì)菌，獲得與分離菌株形態(tài)、理化特性及16S rRNA基因序列一致的菌株。

2.5 分離菌16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)16S rRNA基因的通用引物擴(kuò)增出1 500 bp的片段，純化測(cè)序后提交NCBI獲得登錄號(hào)為SUB6567018。將16S rRNA基因序列與GenBank中已有氣單胞菌屬的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌株MYHY01序列與A.veronii的同源性最高。在基于分離菌株的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有氣單胞菌屬的序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，可判定該分離菌株為A.veronii。

表1 分離菌株MYHY01的生理生化特性Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of the isolated strain MYHY01

表2 分離菌株MYHY01的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotics sensitivities of the isolated strain MYHY01

2.6 患病大口黑鱸組織病理特征觀察

病魚(yú)肝臟肝細(xì)胞腫脹，顆粒變性、水泡變性，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝血竇體積縮小(圖4A)。脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、壞死，黑素巨噬細(xì)胞中心明顯，紅髓淤血、出血(圖4B)。肌纖維腫脹，排列紊亂，橫紋消失，部分肌纖維溶解、斷裂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4C)。腎臟腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死，部分管腔內(nèi)有均質(zhì)紅染的蛋白，形成管型；腎小球腫大，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；腎間質(zhì)疏松，造血組織細(xì)胞減少，巨噬細(xì)胞與中性白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4D)。鰓小片上皮細(xì)胞腫脹，與毛細(xì)血管分離，毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血、出血，鰓小片基部上皮下表增生，多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4E)。皮膚真皮血管擴(kuò)張淤血、出血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4F)。

3 結(jié)論與討論

氣單胞菌(Aeromonassp.)感染在我國(guó)呈現(xiàn)廣泛流行趨勢(shì)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。致病性氣單胞菌分為3個(gè)復(fù)合群，即嗜水復(fù)合群、豚鼠復(fù)合群與溫和復(fù)合群。嗜水復(fù)合群主要包括嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)等，豚鼠復(fù)合群主要包括豚鼠氣單胞菌(A.caviae)和中間氣單胞菌(A.media)等，溫和復(fù)合群主要包括溫和氣單胞菌(A.sobria)、維氏氣單胞菌和簡(jiǎn)氏氣單胞菌(A.jandaei)等[18]。維氏氣單胞菌同嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌被認(rèn)為是氣單胞菌中致病性最強(qiáng)的3種細(xì)菌，強(qiáng)致病性與其能產(chǎn)生氣溶素、溶血素、腸毒素、胞外蛋白酶、鞭毛、菌毛、S層蛋白、脂多糖和外膜蛋白等多種毒力因子有關(guān)[19]。研究證實(shí)，維氏氣單胞菌感染草魚(yú)[2]和花斑副沙鰍[6]分別具有6種和4種毒力因子基因。但本試驗(yàn)并未對(duì)維氏氣單胞菌毒力因子進(jìn)行檢測(cè)，有待進(jìn)一步研究。維氏氣單胞菌是一種人、獸和水生動(dòng)物共患的條件致病菌，現(xiàn)已被國(guó)家列為食品和水體安全的檢測(cè)對(duì)象[20]，應(yīng)引起人們廣泛關(guān)注和高度重視。

維氏氣單胞菌感染大口黑鱸剖解病變主要表現(xiàn)為體表潰瘍，肝臟、脾臟與腎臟腫大；組織病理?yè)p傷主要表現(xiàn)為肌纖維呈波浪狀、排列紊亂、肌纖維斷裂、肌漿溶解，肝臟肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死，脾臟淋巴細(xì)胞壞死、紅髓出血，腎臟腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死及腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，這與龍波等[21]報(bào)道的維氏氣單胞菌感染加州鱸的病理?yè)p傷基本相同。但與維氏氣單胞菌感染的其他宿主不盡相同，感染西伯利亞鱘引起心臟腫大，外表呈現(xiàn)凹凸不平的瘤狀[4]；感染中華絨螯蟹引起肝胰腺壞死[11]；感染凡納濱對(duì)蝦引起軟殼病，肝胰腺呈糊狀[12]；感染大鯢引起體表白斑、胃腸道出血[13]。維氏氣單胞菌感染黃顙魚(yú)[8]、中華絨螯蟹[11]、凡納濱對(duì)蝦[12]、金魚(yú)[22]不同分離株的LD50分別為3.98×104、6.92×104、8.7×105、1.4×107cfu/mL，毒力均高于本研究中的分離菌株。由此可見(jiàn)，維氏氣單胞菌感染在不同宿主間會(huì)引起不同的病理?yè)p傷，這可能與宿主的種屬特異性和不同菌株的毒力差異有關(guān)，毒力差異又與毒力因子種類及其數(shù)量有關(guān)，毒力因子中的氣溶素則被認(rèn)為是感染魚(yú)類出血現(xiàn)象的主要因子[23]。

本研究結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌對(duì)頭孢呋辛、大觀霉素、新霉素、慶大霉素和多黏菌素B等藥物敏感，但對(duì)卡那霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明等藥物耐藥。結(jié)合《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2019年2號(hào)》，推薦使用新霉素控制維氏氣單胞菌感染疫情。本研究分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與高彩霞等[2]、田甜等[3]、高通等[6]、龍波等[21]報(bào)道的維氏氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在差異，分析原因可能與不同菌株來(lái)源和不同地區(qū)的用藥習(xí)慣有關(guān)。鄧玉婷等[24]研究表明，廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)689株維氏氣單胞菌對(duì)14種抗菌藥物相對(duì)敏感，多重耐藥率為1.74%；而耿昕穎等[25]研究表明，東北地區(qū)52株分離菌株中，多株對(duì)11種抗菌藥物表現(xiàn)出5種多重耐藥性，6—10重耐藥分別達(dá)到了9.62%、21.15%、40.38%、15.38%、13.46%。因此，在藥物選擇上應(yīng)根據(jù)國(guó)家漁業(yè)用藥準(zhǔn)則，篩選敏感藥物科學(xué)用藥，避免耐藥菌株的產(chǎn)生。鑒于維氏氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重危害，針對(duì)性的免疫預(yù)防也已受到科研工作者們的重視，先后開(kāi)展了DNA疫苗[26]、菌影疫苗[27]、菌蛻疫苗[28]、滅活疫苗[29]等的研究；另有研究表明，使用腸道益生菌對(duì)控制維氏氣單胞菌感染具有一定作用[30]；同時(shí)也有研究表明，五倍子、黃連的水煎劑對(duì)維氏氣單胞菌有抑制作用[31]。這些研究為水產(chǎn)養(yǎng)殖上維氏氣單胞菌感染的有效防控提供了重要的技術(shù)支撐，但還需開(kāi)展其耐藥機(jī)制研究，以期控制維氏氣單胞菌耐藥性的進(jìn)一步產(chǎn)生。

致謝：本研究得到了四川農(nóng)業(yè)大學(xué)耿毅教授的大力幫助，在此表示衷心的感謝。