接種蚜蟲后不同煙草品種茉莉酸含量變化研究

孫計平，陳 飛，李雪君，孫 煥，李旭輝

(河南省農業(yè)科學院 煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南 許昌 461000)

煙蚜是世界性害蟲，寄主植物非常廣泛，主要有茄科、豆科、十字花科、菊科等植物[1]。煙蚜是煙草的主要害蟲之一，近年來危害程度呈上升趨勢。煙蚜分泌的“蜜露”甜而黏，常誘發(fā)煙葉產生 “煤污病”，使煙葉表面變黑，影響煙葉品質，此外，煙蚜還傳播黃瓜花葉病病毒(CMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種病毒病，造成的損失大于直接危害[2]。在農業(yè)生產上，施用化學農藥見效快，是煙農防治煙蚜的重要手段[3]，但隨著農藥用量的增加，蚜蟲容易產生抗藥性，還會增加農民負擔、造成環(huán)境污染。在煙葉生產上，防治蚜蟲最有效的方法是推廣抗蚜蟲品種。周婷婷等[4]采用葉碟法研究了煙蚜對20個煙草品種的取食選擇性，認為煙蚜成蟲的選擇性在不同煙草品種間差異明顯，同時認為葉綠素和可溶性蛋白含量低的煙草品種抗蚜性強。

關于煙草品種抗蚜機制的研究較少，不同煙草品種遭受昆蟲侵襲時可能會誘導不同的信號途徑來抵御其侵食。茉莉酸是重要的植物激素，也是植物抗蟲的主要信號分子，在植物防御昆蟲中發(fā)揮著重要作用[5-7]，刺吸式口器和咀嚼式口器昆蟲取食煙草時，煙草體內的一氧化氮信號分子和茉莉酸的含量會發(fā)生顯著變化。趙麗艷[8]研究發(fā)現，蚜蟲取食小麥激活了茉莉酸信號傳導途徑。王祎等[9]研究認為，供鉀充足條件下，小麥受到蚜蟲危害后體內茉莉酸含量顯著提高。黃智鴻等[10]研究認為，榆癭蚜取食榆樹葉片后，可激活榆樹體內茉莉酸信號傳導途徑，誘導榆樹葉片茉莉酸含量增加。煙草葉片受到昆蟲咬食后茉莉酸含量顯著增加，噴施外源茉莉酸能顯著提高煙草品種的抗蚜性[11-12]，但煙草植株受到蚜蟲侵襲后，體內茉莉酸含量變化的相關研究較少。鑒于此，對不同煙草品種進行蚜蟲抗性鑒定，并比較不同煙蚜抗性品種接種蚜蟲前后煙株茉莉酸含量的變化，以期揭示不同煙草品種對蚜蟲的防御響應機制，并為煙草抗蚜材料的進一步應用提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

12個供試煙草品種具體見表1，均由河南省農業(yè)科學院煙草研究所提供。

1.2 不同煙草品種的抗蚜性鑒定

2019年3月，在河南省農業(yè)科學院煙草研究所育苗大棚，采用漂浮育苗培育煙苗，每個煙草品種90株。

1.2.1 煙蚜對不同煙草品種的選擇性 煙苗培養(yǎng)至5～6片真葉時取樣，采用葉碟法[4,14]，試驗容器為長方形白色透明塑料盒，長40 cm、寬30 cm、高13 cm，塑料盒底部鋪1層2 cm厚的浸水脫脂棉，上面覆蓋1層濾紙進行保濕，每個煙草品種取20 cm2左右的完整葉片1片，按編號順序擺放一圈，于中間放置120頭無翅4齡成蚜(按每個品種10頭計算)，然后用防蟲網(孔徑0.15 mm)封口。試驗重復3次。分別于接蟲后2、4、8、24 h調查每片葉子上的蚜蟲數量，盡量輕拿輕放，不影響蚜蟲取食。每個品種煙蚜數量取4次調查數據的平均值，煙蚜數量與感蟲對照品種SpeightG-28相比，即為該品種的煙蚜選擇性蚜量比i1。

表1 參試品種 Tab.1 Test varieties

1.2.2 煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性 參考專利《一種煙蚜在不同煙草品種上的繁殖力鑒定方法》[15]，并略有改動。煙苗培養(yǎng)至3～4片真葉時，移栽到花盆中培養(yǎng)，每盆1株，每個品種20盆，花盆直徑10 cm、高10 cm，漂浮育苗基質與土按1∶1混合成培養(yǎng)土。緩苗7 d后，每個品種選取9盆長勢一致的壯苗用于比較煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性試驗，剩余煙苗繼續(xù)培養(yǎng)，用于茉莉酸含量測定。煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性測定：每株接種1頭4齡無翅成蚜作為母蚜。試驗在光照培養(yǎng)箱內進行，設置環(huán)境條件：光照L∶D=14∶10，溫度白天25 ℃，夜晚20 ℃，相對濕度60%～80%。1～30 d每天觀察1次，分別調查母蚜在每個煙草品種上的產蚜數量，記錄后每天將所產幼蚜移去，記錄母蚜死亡情況，直至所有試驗母蚜死亡為止，試驗結束。分別統(tǒng)計煙蚜在每個品種每株上的繁殖總量。每個品種上煙蚜繁殖總量與對照品種SpeightG-28煙蚜繁殖總量相比，即為該品種的煙蚜繁殖量蚜量比i2。

煙草品種抗蚜性評價參考《煙草品種抗蟲性評價技術規(guī)程》[16]：高抗(i≤0.25)、抗(0.251.25)?？寡林笖礽取i1和i2的均值[17]。

1.3 煙株茉莉酸含量對接種蚜蟲的響應

漂浮育苗培育煙苗，6～7片真葉時取樣，每個品種選擇有代表性9株接種蚜蟲，每株接種4齡無翅成蚜20頭，接蟲前和接蟲后5 h分別取煙葉樣品并用錫箔紙包裹，于液氮中冷凍，-80 ℃保存。3株混合取樣作為1個重復，試驗3次重復。

茉莉酸含量測定參考任琴等[18]的方法，略作修改：稱取0.1 g煙葉樣本，在液氮中充分研磨；加入1 mL 80%甲醇提取液,置于-20 ℃冰箱中過夜；然后于4 ℃、8 000 r/min離心1 h，取上清液，過C-18固相萃取柱。過柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干，保存?zhèn)溆?；上機前加入pH值為7.4的 PBS緩沖液(1 mL定容)。混勻后在室溫條件下放置30 min，然后4 ℃離心(8 000 r/min、15 min)，取上清液并暫時保存于4 ℃冰箱，采用超高效液相色譜測定[9]。

1.4 數據處理

采用Excel 2007和DPS 14.5軟件對數據進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同煙草品種的煙蚜抗性分析

由表2可見，煙蚜成蟲對不同煙草品種的選擇差異較大，豎把老母雞2113的煙蚜選擇性蚜量比為0.25，說明煙蚜對其選擇性低；其次為茄棵和胎里肥2411，煙蚜選擇性蚜量比分別為0.36和0.37；王坡二煙蚜選擇性蚜量比為0.46，說明煙蚜對其選擇性也較低。煙蚜對豎把老母雞2113、茄棵、胎里肥2411和王坡二4個品種的選擇性極顯著低于其他品種。務川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33等4個品種煙蚜選擇性蚜量比在0.60～0.70；螺絲頭2474和云煙97的煙蚜選擇性蚜量比較高，與前期研究結果[17]一致，中煙100煙蚜選擇性蚜量比略高于對照SpeightG-28。

煙蚜在不同煙草品種上的繁殖量差異較大，螺絲頭2474上的煙蚜繁殖量最多，煙蚜繁殖量蚜量比為1.56，極顯著高于其他品種；其次為云煙97，煙蚜繁殖量蚜量比為1.34；煙蚜在務川黑煙繁殖量較少，蚜量比為0.50；煙蚜在王坡二上繁殖量最少，蚜量比為0.47，極顯著低于其他品種；豎把老母雞2113、茄棵、胎里肥2411、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33等6個品種繁殖量蚜量比在0.54～0.77，在參試材料中繁殖量居中。

煙蚜在不同煙草品種上的存活時間差異較大，比較來看，煙蚜在SpeightG-28葉片上的存活時間最長，其次為云煙97，煙蚜在王坡二上的存活時間最短。

根據煙草品種抗蟲性評價方法，參考抗蚜指數和煙蚜存活時間，判定王坡二、豎把老母雞2113、茄棵和胎里肥2411為抗蚜品種；務川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33為中抗煙蚜品種；中煙100為感蚜品種；云煙97和螺絲頭2474為高感蚜蟲品種。

表2 不同煙草品種蚜蟲抗性比較Tab.2 Comparison of Myzus persicae(Sulzer) resistance in different tobacco varieties

2.2 不同抗蚜性煙草品種接種蚜蟲前后煙株茉莉酸含量的變化

不同煙草品種接種蚜蟲前后的茉莉酸含量見圖1。由圖1可見，所有煙草品種接蚜蟲后茉莉酸含量均表現為極顯著增加。

接蟲前各煙草品種的茉莉酸含量整體表現為抗蚜>中抗>感蚜>高感，且抗蚜品種茉莉酸含量極顯著高于其他品種，中抗品種茉莉酸含量極顯著高于感蚜和高感品種。接種煙蚜后各煙草品種茉莉酸含量仍表現為抗蚜>中抗>感蚜>高感。茄棵在所有參試品種中茉莉酸含量在接蟲前后均最高，接蟲前顯著高于其他品種，接蟲后極顯著高于其他品種。

不同煙草品種受蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增加量不同，由圖2可見，茄棵、胎里肥2411、豎把老母雞2113和王坡二4個抗蚜煙草品種受到蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增加較多，均超過150 ng/g，其中以茄棵茉莉酸含量增加最多，其次為胎里肥2411，這2個品種茉莉酸增加量顯著高其他品種，4個抗蟲品種茉莉酸增加量極顯著高于中抗品種、感蟲品種和高感品種；中抗品種茉莉酸增加量極顯著高于感蟲品種和高感品種；感蟲和高感品種茉莉酸增加量差異較小，中煙100和云煙97顯著低于螺絲頭2474，其他感蚜材料間差異不顯著。

不同煙草品種受到蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增幅不同，抗蚜品種茉莉酸含量增幅在40%左右，其中以茄棵和胎里肥2411增幅最高，極顯著高于其他品種；感蚜品種茉莉酸含量增幅在10%左右，極顯著低于抗蚜和中抗品種。

2.3 煙草品種蚜蟲抗性與煙葉茉莉酸含量的相關分析

由表3可見，煙蚜選擇性蚜量比、煙草品種抗蚜指數與煙草茉莉酸含量、接蟲后茉莉酸增加量和增加幅度均有較好的相關性，相關系數均大于0.80；煙蚜繁殖量蚜量比與接蟲前后茉莉酸含量、茉莉酸增加量和增幅的相關系數在0.70～0.75。

表3 煙草品種抗蚜性與煙葉茉莉酸含量相關性分析Tab.3 Correlation analysis of aphid resistance and jasmonate content in tobacco varieties

3 結論與討論

植物遭受到害蟲侵襲后，通過啟動體內防御反應系統(tǒng)產生系統(tǒng)誘導抗性，茉莉酸是普遍存在于高等植物體內的內源生長調節(jié)物質，與植物的抗逆性密切相關[19]，茉莉酸最重要的作用就是傷口誘導防御響應[20]，在昆蟲取食后，植物體內茉莉酸含量明顯增加，番茄茉莉酸合成缺失的突變體易受到害蟲咬食[21]。前期很多研究認為，茉莉酸途徑是植物防御咀嚼式昆蟲的主要途徑[19-21]，煙草天蛾幼蟲取食后，煙草內源茉莉酸含量升高了9倍[22]。趙麗艷[8]研究發(fā)現，蚜蟲取食小麥既激活了茉莉酸介導的信號傳導途徑，也激活了水楊酸介導的信號傳導途徑，二者之間存在協(xié)同作用，茉莉酸與水楊酸信號傳導途徑起主導作用的時間段可能不同[23]。王祎等[9]研究認為，麥管長蚜取食高鉀小麥激活了其體內的茉莉酸信號傳導途徑。煙草的抗蚜性是煙草對蚜蟲的一種可遺傳的防御反應，不同煙草品種抗蚜性差異較大。應用外源茉莉酸和茉莉酸甲酯能夠誘導植物產生生物堿、蛋白酶抑制劑、多酚氧化酶等對害蟲有趨避和妨礙行為的化合物，干擾昆蟲的行為[24]，但采用外施茉莉酸方式提高植物抗蟲性成本較高。在遇到蚜蟲侵襲條件下，煙草品種內源茉莉酸含量變化的研究鮮有報道。本研究選用不同煙草品種為試驗材料，煙蚜選擇性試驗和繁殖量試驗結果表明，云煙97、螺絲頭2474為高感蚜蟲品種，中煙100和SpeightG-28為感蚜蟲品種，這和本實驗室前期研究結果[17]一致，和邱睿等[13]、周婷婷等[4]的研究結果也基本一致；通過前期大量種質資源抗蚜性篩選，進一步鑒定出茄棵、胎里肥2411、豎把老母雞2113和王坡二4個品種為抗蚜材料；務川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33煙蚜抗性為中抗。茉莉酸含量分析結果表明，不同煙草品種內源茉莉酸含量差異較大，抗蚜品種茉莉酸含量極顯著高于中抗品種和感蚜品種；接種蚜蟲后，12個參試煙草品種茉莉酸含量均表現為極顯著增加，不同煙草品種茉莉酸含量增加量差異也較大，4個抗蚜蟲品種茉莉酸增加量極顯著高于中抗品種、感蚜品種和高感品種；中抗品種茉莉酸增加量極顯著高于感蟲品種和高感品種；抗蚜品種受到蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增幅也明顯高于其他品種。不同煙草品種抗蚜指數與茉莉酸含量及增加量、增幅的相關分析表明，煙草品種煙蚜選擇性和抗蚜指數均與煙草內源茉莉酸含量有較好的相關性，且與蚜蟲侵襲后茉莉酸增加量和增幅也有較好的相關性，茉莉酸含量可以作為煙草品種抗蚜鑒定的生理指標。