一種瑤浴散劑質(zhì)量標準的試驗研究

李金洲，陳子雋，劉玟君，盧惠敏，林玉港，魏江存，陳 勇

（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心，南寧 530022；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤藥研發(fā)中心，南寧 530022）

瑤族人民生活在山高林密、氣候濕熱的崇山峻嶺之中，這里常年高溫多雨，毒蟲遍地，瘟瘴盛行［1］。在長期的生活實踐中，瑤族人民總結(jié)出了一套集養(yǎng)生、保健、祛病于一體的瑤族醫(yī)藥文化，瑤浴就是瑤族醫(yī)藥的杰出代表之一。瑤浴具有祛風除濕、活血化瘀、排汗解毒等功效。由于瑤浴的獨特功效，其與芬蘭的桑拿浴、土耳其的蒸汽浴共同被譽為世界上優(yōu)秀的三大沐浴文化。2008 年6 月，瑤浴被列入第二批國家非物質(zhì)文化保護遺產(chǎn)名錄［2］。目前市面上瑤浴產(chǎn)品琳瑯滿目，瑤浴養(yǎng)生館的數(shù)目也在逐年增多，可見瑤浴這種養(yǎng)生方式越來越受到人們的青睞。

但是，尚缺乏標準對瑤浴產(chǎn)品進行相關的質(zhì)量控制，對于單個瑤浴產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究也比較少見。目前國內(nèi)對瑤浴及瑤浴產(chǎn)品質(zhì)量標準的研究還十分欠缺，瑤浴的保護與傳承還有很多工作要做［3］。為發(fā)揚、推廣瑤浴的使用，保障其使用安全，本試驗研究了取自瑤族聚居地——廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣的一種民間常用瑤浴粉，該瑤浴粉具有安神助眠的作用，在當?shù)鼐哂休^高的知名度，其主要以合歡皮、石菖蒲、雞血藤、茯神、三七葉、樟樹、刺五加、柚子葉、玫瑰花等產(chǎn)自廣西金秀圣塘山的天然藥材組成。試驗觀察瑤藥粉末顯微性狀和顯微鑒別特征，并對其進行薄層鑒別檢查；按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）通則中的方法對藥粉進行水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量進行測定［4］；采用HPLC 法測定藥粉中β-細辛醚的含量。以期對該瑤浴粉進行質(zhì)量控制，并為其他瑤浴產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圣塘山瑤浴粉（生產(chǎn)批號180312、180414、180512、180616、180712、180812、180912、181014、181016、181116），β-細辛醚對照品（生產(chǎn)批號RQA579，純度≥98%，畢得醫(yī)藥）；合歡皮陰性對照樣品（自制），雞血藤陰性對照樣品（自制），石菖蒲陰性對照樣品（自制），合歡皮（20190601）、雞血藤（20190501）、石菖蒲（20190501）對照藥材均購自廣西仙茱中藥有限公司，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物學教研室郭敏副教授鑒定，確定為豆科植物合歡（Albizia julibrissinDurazz.）的干燥樹皮、豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥藤莖、天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）的干燥根莖。

Waters e2695 高效液相色譜儀，PhenomenexC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；徠卡DM2500 光學生物顯微鏡、DFC500 圖像分析系統(tǒng)，德國萊卡儀器公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器；電熱鼓風干燥箱、馬弗爐，上海實驗儀器廠有限公司；SX2-4-10 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；硅膠G 薄層板，青島海洋化工廠。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)項目檢查 水分測定按2015 版《中華人民共和國藥典》［4］（四部）“0832 水分測定法”中的烘干法，浸出物測定按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）“2201 浸出物測定法”熱浸法，因考慮到瑤浴粉的使用方式，在浸出物測定法中只進行了熱浸法，總灰分測定和酸不溶性灰分按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）“2302 灰分測定法”。

1.2.2 制片方法 將瑤浴散劑粉碎后，過80 目篩，取適量，用水合氯醛溶液透化后稀甘油裝片，將裝片置顯微鏡下觀察、測量、拍照。

1.2.3 色譜條件 Phenomenex C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，流動相甲醇-0.1%磷酸（65∶35），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長257 nm，進樣量10 μL。

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取β-細辛醚對照品24.75 mg，用純甲醇溶解并定容至50 mL 容量瓶中，制得約0.495 mg/mL β-細辛醚對照品溶液，微孔濾膜過濾，備用。

1.2.5 供試品溶液的制備 取瑤浴粉末0.50 g 置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞稱定重量，浸泡1 h，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，取續(xù)濾液即得［5］。

1.2.6 陰性對照溶液的制備 取缺石菖蒲樣品0.50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照“1.2.5”方法制備陰性對照溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)項目檢查

水分、浸出物、總灰分和酸不溶性灰分測定結(jié)果見表1。

2.2 顯微鑒別

由圖1 可知，粉末中有類圓形或長條形的石細胞，壁厚，孔溝明顯，纖維成束，周圍細胞含有草酸鈣方晶，形成晶纖維，符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的合歡皮的典型顯微特征。

圖1 瑤浴散劑中合歡皮的顯微特征

由圖2 可見，粉末中具有明顯的具緣紋孔導管，其中還含有黃棕色物質(zhì)。紅棕色塊遍布視野，該特征符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的雞血藤的顯微特征。

圖2 瑤浴粉中雞血藤的顯微特征

由圖3 可知，粉末中可見多角形草酸鈣方晶、類圓形分泌細胞，細胞內(nèi)充滿著紅棕色分泌物，該特征符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的石菖蒲的典型顯微特征。

圖3 瑤浴粉中石菖蒲的顯微特征

2.3 TLC 定性鑒別

2.3.1 瑤浴粉與合歡皮薄層鑒別 取瑤浴粉2.0 g，加入50%甲醇40 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL 溶解，用正丁醇振搖提取2 次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，得到試品溶液。取合歡皮對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；另取缺合歡皮陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。按照2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502 進行試驗，分別吸取上述3 種溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%三氯化鋁溶液加熱顯色，置于紫外燈（365 nm）下檢視（圖4）。由圖4 可知，供試品色譜在與對照藥材相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照處無斑點干擾。

圖4 合歡皮TLC 色譜

2.3.2 瑤浴散劑與雞血藤薄層鑒別 取瑤浴粉2.0 g，加入20 mL 乙醇超聲提取30 min，過濾，濾液蒸干，加5 mL 水溶解，用5 mL 乙酸乙酯萃取2 次，揮干乙酸乙酯，殘渣加甲醇溶解，得到供試品溶液。取雞血藤對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；另取缺雞血藤陰性樣品2.0 g，同法制成陰性對照溶液。按照2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502 進行試驗，分別吸取上述3 種溶液各 2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（30∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（254 nm）下檢視（圖5）。由圖5 可知，供試品色譜在與對照藥材相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，可見陰性對照無斑點干擾。

圖5 雞血藤TLC 色譜

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“1.2.3”色譜條件進樣測定，記錄色譜（圖6）。由圖6 可知，理論塔板數(shù)按β-細辛醚峰計不低于3 000，分離度均大于1.5，其他成分對測定無干擾。

圖6 高效液相色譜

2.4.1 線性關系考察 取對照品溶液 1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 49.5、99.0、148.5、198.0、247.5 μg/mL 的標準溶液，取適量進樣測定，記錄色譜圖。以β-細辛醚質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得β-細辛醚的回歸方程為Y=4.73×104X-7.85×105，（n=5，R=0.999 9），結(jié)果表明，β-細辛醚在質(zhì)量濃度為 49.5～247.5 μg/mL 呈現(xiàn)良好的線性關系（圖7）。

圖7 β-細辛醚標準曲線

2.4.2 定量限與檢測限考察 取對照品溶液適量，倍比稀釋，進樣量為10 μL，以信噪比10∶1、3∶1 分別測定定量限、檢測限。結(jié)果表明，β-細辛醚的定量限為0.92 ng，檢測限為0.31 ng。

2.4.3 精密度試驗 取對照品溶液適量，按色譜條件重復進樣測定6 次，每次10 μL，記錄β-細辛醚的峰面積并計算RSD值。結(jié)果表明，β-細辛醚峰面積的RSD為0.26%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號180312）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h，然后按色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，β-細辛醚峰面積的RSD為0.98%，說明供試品溶液于室溫下放置12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 重復性試驗 取瑤浴散劑樣品適量（批號180312），按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品中β-細辛醚的含量。結(jié)果表明，β-細辛醚的平均含量為0.073 2%，RSD為0.98%（n=6），說明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的瑤浴散劑樣品（180312）適量，共6 份，精密稱定，分別加入一定量的β-細辛醚對照品，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.4.7 耐用性試驗 精密稱取瑤浴散劑樣品（180312）適量，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，考察不同色譜柱（Thermo Acclaim120 C18、Fei?niGen RedClassicalⅡ C18、Phenomenex Gemini C18），流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）對樣品含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當色譜柱、流速和柱溫發(fā)生一定程度變化時，能滿足測試要求，方法耐用性良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

表3 耐用性試驗結(jié)果

2.5 樣品含量測定

取10 批瑤浴散劑樣品各適量，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品含量，結(jié)果見表4。由表4 可知，不同批次的瑤浴粉中β-細辛醚含量在0.071%～0.085%，各批次大致相同，且RSD符合2015 版《中華人民共和國藥典》中的要求。故建議以不低于均值80%設限，即該瑤浴粉中β-細辛醚含量不得低于0.064%。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

石菖蒲具有鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化等藥理作用，與本瑤浴粉的主要功效一致，故選用石菖蒲中主要化學成分作為含量測定的指標成分［6，7］。石菖蒲中 α-細辛醚和 β-細辛醚是 2 種主要的揮發(fā)油成分，故在試驗過程中對石菖蒲中的α-細辛醚進行了含量測定，與β-細辛醚相比含量更低，因此最后選用β-細辛醚作為瑤浴粉中的指標成分［8］。合歡皮具有解郁安神的功效，用于心神不安。查閱2015 版《中國藥典》（一部）發(fā)現(xiàn)，合歡皮含量測定的指標性成分（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，但在試驗中發(fā)現(xiàn)，該成分在瑤浴粉中含量太低，難以檢測［9］。雞血藤是一味具有補血活血、舒筋活絡的藥材，該作用與瑤浴粉的保健養(yǎng)生功效基本一致，故選擇雞血藤和合歡皮進行薄層色譜鑒別。在進行薄層色譜鑒別時，按照2015 版《中華人民共和國藥典》（一部）中合歡皮和雞血藤的薄層展開條件進行展開，發(fā)現(xiàn)并不能取得較好的展開效果，只能重新對薄層展開條件進行摸索。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)樟木［10］、三七葉［11］、柚子葉［12］、玫瑰花［13］中均含有黃酮類化合物，且結(jié)構(gòu)相似，陰性干擾嚴重。故最后確定選用雞血藤和合歡皮進行薄層定性，且這兩味藥也是瑤浴散劑中的主要成分，符合中藥復方質(zhì)量控制的相關規(guī)定［14］。

試驗初步建立了廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣瑤族人民常用的一種瑤浴散劑的質(zhì)量標準，還有許多需要完善的地方，有待進一步的試驗研究。希望通過該試驗能給瑤浴產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究提供一定的參考依據(jù)和研究思路，建立瑤浴產(chǎn)品的初步質(zhì)量標準來對市面上常見的瑤浴產(chǎn)品進行控制，確?，幵‘a(chǎn)品的安全性、有效性和可控性。