土壤中重金屬銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)生化指標(biāo)的影響

張 麗，趙忠濤，顧 靜

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400）

近年來(lái)，由銅、鉛等重金屬所造成的農(nóng)業(yè)環(huán)境污染變得越來(lái)越嚴(yán)重。重金屬進(jìn)入土壤后難以被生物降解，除了不可逆轉(zhuǎn)和長(zhǎng)期性外，其隱蔽性和潛伏性更強(qiáng)，從而使凈化和修復(fù)受污染的土壤變得很困難。因此，人類的生存環(huán)境和生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展嚴(yán)重地受到了重金屬污染的影響［1］。

重金屬銅是植物生長(zhǎng)必不可少的重要微量元素，它是某些氧化還原酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、細(xì)胞色素氧化酶和蛋白質(zhì)的關(guān)鍵組成成分。因此，銅較大地影響著發(fā)生在植物體內(nèi)的氧化還原過(guò)程。在植物的葉綠體中銅也廣泛存在，其主要作用是參與植物的光合作用［2］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，銅鹽還是一種重要的農(nóng)藥和殺菌劑，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。在正常情況下，植物對(duì)銅的吸收主要是通過(guò)受代謝控制的主動(dòng)吸收過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，當(dāng)土壤中重金屬銅濃度超過(guò)一定值時(shí)，會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一定的毒性和負(fù)面影響。輕則使植物的新陳代謝過(guò)程受到干擾，將阻止植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，重則會(huì)導(dǎo)致植物的老化和凋亡。土壤中重金屬銅造成的污染可以通過(guò)使用草坪進(jìn)行修復(fù)，這樣土壤不僅可以得到凈化，而且對(duì)人類的生產(chǎn)條件和生活環(huán)境也有著有益的影響［3］。為此，本研究通過(guò)分析不同濃度銅對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)生化指標(biāo)的影響，以期為制定中國(guó)重金屬污染地區(qū)土壤中重金屬銅的含量標(biāo)準(zhǔn)，以及為開(kāi)發(fā)利用潤(rùn)草1 號(hào)修復(fù)被重金屬銅污染的土壤、草坪綠地建設(shè)和規(guī)劃提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為潤(rùn)草1 號(hào)，是中國(guó)廣泛栽培的一種早熟禾品種，由鎮(zhèn)江潤(rùn)祥園林科技發(fā)展有限公司培育及提供。選用經(jīng)過(guò)烘干滅菌后的3～5 mm 直徑的細(xì)沙為培養(yǎng)基質(zhì)。重金屬銅添加形式為 CuSO4·5H2O，分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將沙子過(guò) 5 mm 目篩后，用 2%（V/V）HNO3溶液浸泡過(guò)夜，并用去離子水洗凈，然后洗凈的沙子放在托盤(pán)里置于干燥箱中，在105 ℃條件下烘干1 h 滅菌，再在80 ℃條件下烘干約3 h 至恒重。分別稱重6 kg沙子，裝入25個(gè)塑料花盆，所用花盆的上口直徑為25.8 cm、下口直徑為16.3 cm、高為22.5 cm。試驗(yàn)時(shí)，以不添加重金屬銅的處理方法作為對(duì)照，并將重金屬銅的脅迫濃度設(shè)定為5、10、20、50、100 mg/kg（以Cu2+計(jì)量重金屬銅的脅迫濃度），每處理重復(fù)4 次。

根據(jù)預(yù)設(shè)的重金屬銅的脅迫濃度，在每個(gè)花盆中添加5 種不同濃度的重金屬銅溶液各1 000 mL。每天噴施適量的去離子水，使每個(gè)花盆的重量保持不變。平衡2 周后，在每個(gè)花盆中添加Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液20 mL。潤(rùn)草1 號(hào)種子在去離子水中浸泡24 h后，再在每個(gè)花盆中播種300 粒。每天繼續(xù)噴施適量的去離子水，以確保每個(gè)花盆的重量保持不變。室溫25 ℃左右培養(yǎng)，每日光照8 h，全天通氣。種植1 個(gè)月后，分別取樣分析。

1.3 測(cè)定方法

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定潤(rùn)草1 號(hào)葉片中總蛋白質(zhì)的含量；采用蒽酮法測(cè)定潤(rùn)草1 號(hào)葉片中可溶性糖的含量；潤(rùn)草1 號(hào)葉片中SOD 的活性和POD 的活性采用試劑盒法測(cè)定。測(cè)定時(shí)所使用的主要儀器是UV-2100 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中總蛋白質(zhì)含量的影響

在植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)主要是各種代謝酶，其含量高低反映了細(xì)胞在植物體內(nèi)的整體代謝能力［4］，在某種程度上也反映了植物的生長(zhǎng)潛力。當(dāng)重金屬離子進(jìn)入植物體時(shí)，會(huì)與其他化合物結(jié)合成螯合物或者生成絡(luò)合物，從而抑制了植物的新陳代謝，特別是影響蛋白質(zhì)合成。因此，可溶性蛋白質(zhì)的含量是植物是否受到重金屬脅迫的一個(gè)重要指標(biāo)［5］。從圖1 可以看出，經(jīng)銅處理后，潤(rùn)草 1 號(hào)葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)生了顯著的變化。隨著銅濃度的增大，可溶性蛋白質(zhì)的含量先上升，隨后下降。銅濃度為10 mg/kg 時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值。

圖1 不同濃度銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1號(hào)葉片中總蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 重金屬銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的有機(jī)物之一，也是植物碳和能量的重要來(lái)源。為了適應(yīng)干旱、低溫、重金屬等逆境條件，植物會(huì)積極積累一些可溶性糖，以提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力和降低冰點(diǎn)。可溶性糖是植物在逆境中產(chǎn)生的適應(yīng)性產(chǎn)物，因此有利于增強(qiáng)植物的抗逆性［6］。從圖2 可以看出，銅處理后，潤(rùn)草1 號(hào)葉片中可溶性總糖含量發(fā)生了明顯的變化，隨著銅濃度的增大先升高后降低。銅濃度為20 mg/kg時(shí)，可溶性總糖含量達(dá)到最大值。

圖2 不同濃度銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1號(hào)葉片中可溶性糖含量的影響

2.3 重金屬銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中SOD 活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)最重要的自由基清除酶，它的主要生理功能是消除植物體內(nèi)廣泛存在的超氧陰離子自由基（），使·轉(zhuǎn)變成沒(méi)有毒性的氧氣和毒性比較低的過(guò)氧化氫，并減少具有較大毒性和較高活性的·OH 的生成，從而使植物體內(nèi)存在的自由基保持在較低的水平，以減輕·對(duì)植物的傷害［7］。SOD 的活性水平與植物的抗逆性密切相關(guān)。在面對(duì)中等強(qiáng)度的逆境時(shí)，SOD 的活性增強(qiáng)是為了有效提高植物抵抗逆境的能力，從而使植物能夠適應(yīng)逆境而存活下來(lái)。植物能夠成功地抵抗逆境脅迫的生理基礎(chǔ)就是具有較高的SOD 活性。從圖3 可以看出，銅處理后，隨著銅濃度的增大，潤(rùn)草1號(hào)葉片中SOD活性表現(xiàn)為先上升后下降，發(fā)生了顯著的變化。銅濃度為50 mg/kg 時(shí)，SOD 活性達(dá)到最大值。

圖3 不同濃度銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中SOD 活性的影響

2.4 重金屬銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中POD 活性的影響

過(guò)氧化物酶（POD）在植物的各種組織中廣泛存在，其活性較高，與植物的光吸收、光氧化等有關(guān)［8］。POD 主要生理功能是消除分子氧在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和其他過(guò)氧化物，使自由基保持在較低水平，從而避免自由基對(duì)植物的傷害［9］，在植物的抗氧化代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。POD 是一種更有效的適應(yīng)性酶，反映植物生長(zhǎng)、內(nèi)部代謝和適應(yīng)外部環(huán)境的能力。植物在重金屬的脅迫下，各種組織中廣泛存在的POD 活性表現(xiàn)出明顯的升高或降低。從圖4 可以看出，銅處理后，潤(rùn)草1 號(hào)葉片中POD 活性發(fā)生了顯著的變化，隨著銅濃度的增大表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。銅濃度為20 mg/kg時(shí)，POD 活性達(dá)到最大值。

圖4 不同濃度銅脅迫對(duì)潤(rùn)草1 號(hào)葉片中POD 活性的影響

3 小結(jié)與討論

糖是小分子物質(zhì)，在植物受到滲透脅迫時(shí)起到重要的調(diào)節(jié)作用，脯氨酸在植物體內(nèi)積累時(shí)也需要糖的參與。糖具有較強(qiáng)的氧化還原能力，脯氨酸合成時(shí)所必需的氧化還原能力就是糖通過(guò)氧化磷酸化提供的，它是植物進(jìn)行新陳代謝所必需的基礎(chǔ)物質(zhì)［10］。試驗(yàn)結(jié)果表明，潤(rùn)草1 號(hào)葉片中可溶性糖含量對(duì)重金屬銅的脅迫非常敏感。銅濃度較低時(shí)，可溶性糖含量略有增加，可能是潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)不溶性糖（如淀粉、纖維素等）發(fā)生了降解引起的，也可能是光合作用產(chǎn)生的淀粉在運(yùn)輸過(guò)程中受到了阻礙的結(jié)果，還有可能是葡萄糖酶和蔗糖酶的活性在代謝過(guò)程中出現(xiàn)了反常所引起的［11］。銅濃度較高時(shí)，可溶性糖的含量大幅下降，可能是潤(rùn)草1 號(hào)葉片中進(jìn)行光合作用的整個(gè)系統(tǒng)受到了銅的破壞，造成了葉片內(nèi)不溶性糖發(fā)生分解且不能進(jìn)行正常的運(yùn)輸［11］；也可能是高濃度銅脅迫下，降低了潤(rùn)草1 號(hào)葉片的含水量，使葉片內(nèi)積累的可溶性糖通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用避免細(xì)胞受到傷害。

蛋白質(zhì)是生物體進(jìn)行生命活動(dòng)必不可少的基礎(chǔ)物質(zhì)，生物體內(nèi)細(xì)胞代謝酶的變化情況可以通過(guò)可溶性蛋白質(zhì)含量來(lái)反映。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著銅脅迫濃度的增加，潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)。銅濃度較低時(shí)，為了減輕銅脅迫造成的傷害，潤(rùn)草1 號(hào)葉片以蛋白質(zhì)的合成為主，因此蛋白質(zhì)含量升高。隨著銅濃度的增大，潤(rùn)草1 號(hào)葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，阻礙了蛋白質(zhì)的合成，加快了原有蛋白質(zhì)的分解，導(dǎo)致細(xì)胞代謝酶和可溶性蛋白質(zhì)受到破壞，使?jié)櫜? 號(hào)葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了不同程度的下降。

自由基的產(chǎn)生和清除是植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的兩個(gè)相反過(guò)程，只有在各種保護(hù)酶協(xié)同作用下才能清除產(chǎn)生的自由基，使植物細(xì)胞免受自由基的傷害［12］。重金屬銅脅迫下，潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)各種保護(hù)酶活性也發(fā)生相應(yīng)的改變，但因脅迫濃度的不同而有所不同。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著銅脅迫濃度的增大，潤(rùn)草1號(hào)葉片內(nèi)SOD 的活性先升高后降低。在低濃度銅脅迫下，潤(rùn)草1 號(hào)葉片細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的比較少，SOD 的活性變化也比較小。隨銅脅迫濃度的增大，潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)則產(chǎn)生大量的氧自由基使其濃度迅速增加，SOD 活性也相應(yīng)地增大以歧化活性氧，脅迫下SOD 活性的增大還可能與酶蛋白的大量合成有關(guān)［13］，使?jié)櫜? 號(hào)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化和抗損傷的能力。但當(dāng)產(chǎn)生的自由基大于SOD 清除能力時(shí)，SOD 活性也會(huì)受到自由基的影響，其活性大幅下降甚至完全失去活性，同時(shí)其他代謝酶也會(huì)受到自由基的傷害，甚至引起潤(rùn)草1 號(hào)的凋亡。因此，在重金屬銅脅迫下，高的SOD 活性對(duì)維持潤(rùn)草1 號(hào)對(duì)氧化損傷的整體防御能力具有重要的作用。

活性氧和自由基具有很強(qiáng)的毒害作用，只有保持其產(chǎn)生與清除的平衡，才能使細(xì)胞膜系統(tǒng)免受損傷。抗氧化劑和保護(hù)酶對(duì)平衡起著調(diào)節(jié)與控制作用，若平衡被破壞會(huì)使脂膜的過(guò)氧化作用加劇，對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成破壞［14］。POD 能清除活性氧和自由基，是植物在逆境脅迫下的重要保護(hù)酶類。當(dāng)潤(rùn)草1 號(hào)葉片受銅脅迫后，葉片內(nèi)POD 活性隨著銅脅迫濃度的增大，先應(yīng)激性升高然后降低，在銅脅迫濃度為20 mg/kg 時(shí)潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)POD 活性出現(xiàn)高峰值。POD 活性升高的原因可能是由于銅脅迫濃度小于20 mg/kg 時(shí)，潤(rùn)草1 號(hào)葉片內(nèi)有大量的活性氧（如·、·OH、H2O2等）累積，這些活性氧不但使脂膜的過(guò)氧化作用增強(qiáng)，也使POD 活性升高，從而減輕了活性氧對(duì)脂膜的傷害。當(dāng)銅脅迫濃度大于20 mg/kg時(shí)，潤(rùn)草1 號(hào)葉片受到較大傷害防御能力下降，不能將產(chǎn)生的活性氧及時(shí)除去而生成毒性更大的·OH 自由基，對(duì)脂膜造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，使?jié)櫜? 號(hào)葉片結(jié)構(gòu)遭到破壞；也對(duì)POD 造成傷害活性急劇下降，使其清除活性氧的能力降低，加劇了脂膜的氧化及結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致潤(rùn)草1 號(hào)的生理代謝紊亂并加速其凋亡，這也是銅毒害潤(rùn)草1 號(hào)的主要原因。