多糖的化學(xué)修飾及其結(jié)構(gòu)鑒定研究進(jìn)展

謝 苗，亓小妮，吳楊洋，張 鑫，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059）

多糖是自然界中含量最多的一類(lèi)高分子聚合物，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)活性等生物活性［1］，是開(kāi)發(fā)藥品和功能性食品的重要原料。然而，來(lái)自于天然產(chǎn)物的一些多糖本身不具有生物活性或活性很低，或者是因?yàn)槿芙庑院艿投绊懫浠钚园l(fā)揮。例如，茯苓多糖幾乎不具有抗癌活性，但是經(jīng)過(guò)羧甲基化等修飾后，在體內(nèi)和體外都能表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性［2］，硫酸化后的牛樟菇多糖的抗腫瘤活性有顯著提高［3］。

多糖及其衍生物的結(jié)構(gòu)與生物活性有著非常密切的關(guān)系。多糖的化學(xué)修飾主要通過(guò)改變多糖的取代基種類(lèi)、數(shù)目和位置、分子量、空間結(jié)構(gòu)等從而影響其活性。研究表明，在多糖分子中引入合適的離子基團(tuán)能夠顯著改善多糖的水溶性，通過(guò)改變多糖在水溶液中的構(gòu)象提高其活性［4，5］。而且，不同的取代基團(tuán)、取代位置和取代度（DS）對(duì)多糖衍生物的活性有著重要影響［6，7］。目前，多糖化學(xué)修飾的方法主要包括硫酸化、去硫酸化、磷酸化、乙?；⑷ヒ阴；Ⅳ燃谆?、硒化和降解等。

多糖衍生化前后的結(jié)構(gòu)變化會(huì)在一些圖譜如紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）圖譜和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）圖譜上出現(xiàn)某些變化或產(chǎn)生一些特殊信號(hào)，通過(guò)比較修飾前后的圖譜變化，可以反映多糖衍生化發(fā)生成功與否以及取代度高低，進(jìn)而闡明衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再結(jié)合生物活性，有助于揭示和闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系。本研究根據(jù)最新文獻(xiàn)資料，對(duì)多糖的化學(xué)修飾方法、衍生化多糖前后FT-IR 和NMR 圖譜特征的變化進(jìn)行了綜述，以期對(duì)相關(guān)研究提供一些借鑒和參考。

1 多糖的化學(xué)修飾方法

多糖的主要化學(xué)修飾方法總結(jié)見(jiàn)表1，包括修飾類(lèi)型、具體方法、所用試劑和生物活性等。

1.1 硫酸化修飾

硫酸化多糖參與很多生命過(guò)程，如生長(zhǎng)分化、器官發(fā)生、病毒感染、血液凝聚和血管生成等［38］，在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，因此，硫酸化修飾是多糖分子改性中非常重要的一個(gè)研究方向。研究表明，硫酸酯化多糖不僅增強(qiáng)原多糖的生物活性或產(chǎn)生新的藥理作用活性，還能改善原多糖的水溶性［8-13］。多糖的硫酸酯化方法很多，目前常用的方法主要有三氧化硫法、氯磺酸法（Wolfrom）和濃硫酸法。

Zhang 等［8］采用三氧化硫法對(duì)乳桿菌多糖進(jìn)行硫酸化修飾，具體過(guò)程如下：取植物乳桿菌多糖樣品溶于無(wú)水二甲基甲酰胺（DMF）中，攪拌均勻后加入適量三氧化硫吡啶化合物即得到衍生化多糖。張忠等［39］采用氯磺酸法制備硫酸化金耳多糖。用不同的親核試劑溶解樣品，60 ℃保溫0.5 h，緩加氯磺酸反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH，透析，冷凍干燥獲得硫酸化后的金耳多糖。結(jié)果表明，DMF 為最佳溶劑（DS 最高，為1.43），硫酸化金耳多糖的抗氧化能力及抑瘤活性與DS 成正相關(guān)。

三種修飾方法各有優(yōu)劣。三氧化硫法的缺點(diǎn)為三氧化硫類(lèi)藥品價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。濃硫酸法與氯磺酸法類(lèi)似，均由濃硫酸提供硫酸基團(tuán)，吡啶作為催化劑［40］。但多糖易被濃硫酸降解，所以濃硫酸法制備的多糖衍生化產(chǎn)品的得率和取代度往往最低。相比之下，氯磺酸法最優(yōu)，目前廣泛用于吡喃型多糖的硫酸化，該方法簡(jiǎn)單、有效，可在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.2 去硫酸化修飾

硫酸基是天然復(fù)雜多糖（如肝素、某些海藻多糖等）的重要修飾成分，硫酸化多糖是目前研究最為集中的一個(gè)多糖。為了探討硫酸基團(tuán)DS 和取代位置與多糖之間的構(gòu)效關(guān)系，去硫酸化修飾是化學(xué)修飾研究的一個(gè)方向。目前有堿水解、酸水解和甲醇解3 種方法。其中，堿水解法硫酸基的去除率較低，酸水解法中硫酸基的去除率雖然較高，但在酸性條件下S-O 容易發(fā)生斷裂，采用甲醇解糖苷鍵則不受影響［38］。Xu 等［14］通過(guò)甲醇解的方法制得脫硫硫酸化的卡拉膠寡糖。具體操作方法為：將酶解后的卡拉膠寡糖溶于含有DMSO、10%的甲醇和1%的吡啶的混合溶液中，將混合物置于100 ℃反應(yīng)4 h，用蒸餾水透析至少3 d，醇沉，濃縮，冷凍干燥即得脫硫卡拉膠寡糖。

1.3 磷酸化修飾

研究表明，磷酸酯化多糖水溶性明顯增強(qiáng)，具有抗氧化、抗腫瘤和抗衰老的活性［15-19］。常用的方法有磷酰氯法、磷酸鹽法和磷酸法 3 種。Chen 等［16］利用磷酰氯法制備了取代度不同的磷酸化多糖。制備過(guò)程如下：將磷酰氯試劑滴入無(wú)水吡啶中制備磷酸化試劑，多糖樣品溶于DMF，倒入含有磷酸化試劑的三頸燒瓶反應(yīng)得磷酸化南瓜多糖。相比于其前體物，磷酸化多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。在磷酸鹽法中，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉常常被混合使用，Zhang 等［18］采用磷酸鹽法成功制備了磷酸基的含量為14.36%的磷酸化瓜蔞皮多糖。藥理活性結(jié)果表明，修飾后的瓜蔞皮多糖（磷酸基的含量為14.36%）比其前體物抗衰老能力顯著增強(qiáng)。

1.4 乙酰化修飾

有研究表明，乙?；囊肽芨淖兌嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M向次序，最終導(dǎo)致多糖羥基基團(tuán)暴露，改變其物理性質(zhì)，增加其在水中的溶解性，因此對(duì)其生物活性產(chǎn)生影響［41］。例如，對(duì)殼聚糖分子內(nèi)活潑的氨基和羥基基團(tuán)進(jìn)行乙?；揎?，能改善其溶解性，賦予殼聚糖更多的特殊功效［42］。斜頂菌多糖乙?；揎椇?，其抑瘤活性較修飾前有明顯提高，其原因除修飾基團(tuán)自身因素外，還與修飾后水溶性改變有關(guān)［43］。梁進(jìn)等［44］對(duì)茶多糖進(jìn)行乙?；揎?，發(fā)現(xiàn)乙酰化多糖能提高抗凝血活性。因此，利用乙?；揎椷M(jìn)行分子改性是改善多糖理化性質(zhì)、提高其藥理功能的一個(gè)重要途徑。

目前乙酰化修飾中，乙酸酐是最普遍適用的乙酰化試劑，主要有乙酸酐法、吡啶-乙酸酐法和DMF-乙酸酐法 3 種方法。Yang 等［21］在恒溫下滴加適量乙酸酐于pH 為9 羊肚菌多糖溶液，獲得乙酰化羊肚菌多糖（DS 最高為 0.4）。周林等［23］采用吡啶-乙酸酐反應(yīng)體系，將裂褶多糖溶于DMSO，加入120μL 吡啶和不同體積的乙酸酐，透析液經(jīng)干燥獲得乙酰化產(chǎn)物，經(jīng)乙酰化修飾后的多糖分子量明顯降低。Liu 等［25］以 DMF 為溶劑將適量樣品溶解，無(wú)水乙酸酐緩慢滴入，反應(yīng)10 h 后收集含有樣品溶液醇沉干燥即得乙?；总付嗵?，在此條件下多糖的DS 為0.80。結(jié)果表明，DMF-乙酸酐法方便，易于控制產(chǎn)物的DS，修飾產(chǎn)物的水溶性明顯提高。

表1 多糖化學(xué)修飾方法匯總

1.5 去乙?；揎?/h3>

去乙酰化修飾有助于挖掘多糖衍生物潛在的生物活性，研究乙?；鶊F(tuán)的DS 和取代位置與其活性之間的構(gòu)效關(guān)系。目前去乙?；揎椀姆椒ㄓ蠳H2NH2-HIO3法和壓縮法。Zhang 等［26］為了探討硫酸軟骨素的去乙?；a(chǎn)物的潛在生物活性，采用NH2NH2-HIO3法制備了去乙?；蛩彳浌撬?。將樣品軟骨硫酸鈉溶于含1%硫酸肼的無(wú)水肼溶液中，105 ℃密封孵育10 h，乙醇沉淀，復(fù)溶于5%醋酸溶液中，再添加0.5 mol HIO3，置于4 ℃冰箱2 h，乙醚反復(fù)萃取，NaOH 中和水相，然后醇沉，透析，冷凍干燥成功獲得目標(biāo)產(chǎn)物。而He 等［27］采用壓縮法也成功對(duì)殼聚糖進(jìn)行了去乙?；揎?。將殼聚糖和適量NaOH 混合均勻后加蒸餾水稀釋至堿溶液濃度始終保持在5%～15%，反應(yīng)容器置于高壓蒸氣滅菌鍋中反應(yīng)，醇沉干燥獲得去乙?；某潭雀哌_(dá)95%乙?；瘹ぞ厶?。此法借助了高溫，因此便捷且無(wú)污染。

1.6 羧甲基化修飾

茯苓是傳統(tǒng)中藥的“四君八珍”之一，具有廣泛的藥理活性，然而占茯苓高達(dá)93%的茯苓聚糖卻幾乎無(wú)抗腫瘤的作用，但如將其進(jìn)行羧甲基化修飾后，不僅提高了水溶性，還具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性［45］。羧甲基化修飾也是改善多糖生物活性非常重要的一個(gè)途徑。

目前羧甲基化修飾方法主要有水媒法和溶媒法兩種。水媒法是指多糖樣品溶于稀堿溶液，再加入鹵代酸試劑，而溶媒法則是指先將多糖溶于有機(jī)溶劑，再加入堿液堿化，最后加入鹵代酸于適宜條件反應(yīng)。Wang 等［29］采用水媒法將青錢(qián)柳多糖溶于20%NaOH 溶液攪拌后靜置1 h，加入無(wú)水乙醇和一氯乙酸反應(yīng)，透析液冷凍干燥即得羧甲基化多糖。

由于水媒法副反應(yīng)較多，加入酸性試劑會(huì)產(chǎn)生黏稠物質(zhì)，不易分離，故多糖羧甲基化時(shí)傾向于溶媒法。目前相比于水媒法，溶媒法被廣泛應(yīng)用。Li等［46］采用溶媒法制備了羧甲基化羊肚菌多糖。將羊肚菌多糖置于含有20%NaOH 溶液的異丙醇溶液中，冰浴中攪拌反應(yīng)3 h，室溫條件下緩慢滴加氯乙酸，透析，冷凍干燥即得羧甲基化羊肚菌多糖，研究表明羧甲基化多糖比其前體物具有較高的抗炎活性。

1.7 硒化修飾

有研究表明，硒化多糖的生物活性普遍高于多糖和無(wú)機(jī)硒且易被機(jī)體吸收和利用［47］。因此多糖的硒化修飾具有非常重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。目前硒化方法主要有H2SeO3-HNO3-BaCl2法和亞硒酸鈉-稀硝酸法。Wang 等［33］運(yùn)用 H2SeO3-HNO3-Ba?Cl2法將亞側(cè)耳多糖樣品溶于0.8%硝酸溶液，然后將適量亞硒酸與1 mol/L BaCl2溶液混合加入，以制得硒化亞側(cè)耳多糖 Se-HSP。Xiao 等［34］根據(jù)亞硒酸鈉-稀硝酸法制備硒化海藻多糖。

1.8 降解修飾

據(jù)報(bào)道，在一定分子量范圍內(nèi)，一般多糖分子量越小，其表現(xiàn)的生物活性越強(qiáng)［48］，推測(cè)原因可能是因?yàn)樾》肿恿康亩嗵强梢宰杂纱┧笊锬ぁＤ壳皩?duì)于多糖的降解方法主要有H2O2-維生素C 法、Fe2+-H2O2法和超聲降解等。H2O2-維生素C 法、Fe2+-H2O2法是最常用的方法，這2 種方法都是將多糖樣品加水溶解，只是加入的催化劑不同，前者是加入等摩爾的H2O2和維生素C，后者是加入1%FeSO4和H2O2溶液，反應(yīng)液在室溫條件下反應(yīng)2 h，透析后即得目標(biāo)降解多糖。H2O2-維生素C 法獲得的枸杞葉多糖降解后在水溶液中由先前的球形結(jié)構(gòu)變?yōu)殡s亂的環(huán)狀［35］，降解后抗血小板活性也隨之提高，F(xiàn)e2+-H2O2法制備的降解后的黑加侖多糖主要結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化［36］，且多糖分子量越小，其生物活性越強(qiáng)，超聲降解后的多糖的抗氧化活性雖略有提升，但其三螺旋結(jié)構(gòu)遭到了破壞［37］。

2 多糖衍生物結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 紅外圖譜

紅外光譜在取代多糖的定性和定量分析中發(fā)揮著非常重要的作用，而且方便快捷，因此多糖的衍生化成功與否以及衍生化程度往往首先通過(guò)FT-IR 圖譜檢測(cè)。多糖經(jīng)不同方法改性后的多糖衍生物的紅外特征峰歸納見(jiàn)表2。

多糖經(jīng)硫酸化或去硫酸化后S=O、S-O 和C-OS 伸縮振動(dòng)峰會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，硫酸酯化后的黑木耳多糖在1 235 cm-1新出現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)的S=O 伸縮振動(dòng)峰［10］，在819 cm-1出現(xiàn)了對(duì)稱(chēng)的 C-O-S 振動(dòng)峰；同樣，仙人草多糖在硫酸酯化后［12］在1 260 cm-1出現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)的S-O 伸縮振動(dòng)峰，在814 cm-1出現(xiàn)了C-OS 伸縮振動(dòng)峰。多糖經(jīng)乙?；蛉ヒ阴；髸?huì)，出現(xiàn)新的或減少C=O 伸縮振動(dòng)峰和羧基伸縮振動(dòng)峰。青錢(qián)柳葉多糖經(jīng)乙?；揎椇螅? 240 cm-1的吸收峰隨著乙?；〈鹊脑黾佣黾樱?0］。金耳多糖去乙?；?，與天然多糖TAPA1 相比，在1 733.7 cm-1和 1 249.7 cm-1的吸收峰消失［24］，表明乙酰基團(tuán)被完全去除。硒化的海藻多糖在675 cm-1出現(xiàn)了不對(duì)稱(chēng)的 Se-O-C 的伸縮振動(dòng)吸收峰［34］。

2.2 核磁共振圖譜

分子改性后的取代基在NMR 上會(huì)出現(xiàn)特有的信號(hào)峰，因此可以通過(guò)NMR 圖譜信息變化來(lái)驗(yàn)證多糖衍生化成功與否。Chen 等［52］通過(guò)比較硫酸化黃瓜多糖與其前體物（黃瓜多糖）的NMR 圖譜結(jié)果，13C NMR 圖譜中 δ 109～110 ppm 出現(xiàn)了新的共振峰，印證了硫酸化的成功發(fā)生。多糖磷酸化改性后，可以很容易地通過(guò)31P NMR 新出現(xiàn)的信號(hào)峰得到證實(shí)［53］。Chen 等［17］通過(guò)31P NMR 上在 δ-30-5 ppm 新出現(xiàn)的3 個(gè)信號(hào)峰印證了磷酸化成功發(fā)生，結(jié)合13C NMR上C2，C3，C5的化學(xué)位移的變化，最終確認(rèn)了有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)。瓜蔞皮多糖磷酸化后在31P NMR 圖譜中，在δ 0.95～1.73 ppm 區(qū)域出現(xiàn)了較強(qiáng)的且較多的磷共振吸收峰，表明瓜蔞皮多糖磷酸化成功發(fā)生［18］。乙?；揎検欠癯晒Πl(fā)生，可以通過(guò)下列信息進(jìn)行確認(rèn)。乙酰基中甲基碳的信號(hào)在δ 20～22 ppm，甲基氫的信號(hào)在δ 1.8～2.2 ppm，乙?；聂驶盘?hào)在δ 170～180 ppm，與此同時(shí)，在HMBC上會(huì)有甲基氫和羰基的共振信號(hào)出現(xiàn)［54］。Du等［24］從金耳多糖分離的一種天然酸性多糖TAPT1含有0.7%的乙酰基（DS為0.03）。為進(jìn)一步提高其活性，對(duì)TAPT1 分別進(jìn)行乙?；═APT1-ac）和去乙?；═APT1-de）等化學(xué)修飾，TAPT1-ac 和 TAPT1-de 的 DS 分別為 0.23和 0。TAPT1 中因?yàn)橛幸阴；拇嬖?，?H NMR δ 2.02 ppm 處 和13C NMR δ 23.79 ppm 處均有信號(hào)峰出現(xiàn)。乙?；嗵荰APT1-ac在δ 2.02 ppm和δ 23.79 ppm 處的信號(hào)明顯高于金耳多糖TAPT1，表明TAPT1 乙?；晒Πl(fā)生；而在去乙?；a(chǎn)物TAPT1-de 的NMR中，δ 2.02 ppm 和δ 23.79 ppm 處的信號(hào)完全消失，表明去乙?；晒Πl(fā)生。Chen 等［55］采用水媒法制備了羧甲基苦瓜多糖，與其前體物相比，羧甲基化多糖在13C NMR δ 70 ppm 處的信號(hào)明顯增強(qiáng)，表明羧甲基化改性成功。黑木耳多糖羧甲基化后在13C NMR δ 170～180 ppm處出現(xiàn)了新的信號(hào)峰，表明羰基存在，結(jié)合FT-IR 圖譜結(jié)果證實(shí)了羧甲基化成功發(fā)生［30］。

表2 衍生化多糖紅外特征吸收峰

基團(tuán)的取代位置也是多糖結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要參數(shù)。多糖衍生化之后取代基團(tuán)會(huì)影響13C NMR 和1H NMR 的化學(xué)位移，可以通過(guò)NMR 確定衍生化多糖中取代基團(tuán)的位置。有研究發(fā)現(xiàn)，多糖硫酸化后直接與吸電子的硫酸鹽基團(tuán)相連的碳原子會(huì)向較低的磁場(chǎng)位置移動(dòng)，而間接相連的碳原子則會(huì)向較高的磁場(chǎng)位置移動(dòng)［56］，這個(gè)規(guī)律被稱(chēng)為苷化位移規(guī)則，即糖上的羥基被其他基團(tuán)取代后，其相連羥基碳的化學(xué)位移將向低場(chǎng)移動(dòng)［57］。而且，糖環(huán)上不同位置的碳原子發(fā)生取代后，不管是雙糖、寡糖還是多糖，只要取代基相同，其向低場(chǎng)的化學(xué)位移數(shù)值基本一樣［58］。被硫酸基取代后，被取代位置的碳的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)6～9 ppm，通過(guò)比較硫酸酯多糖脫硫前后的13C NMR 譜（必要時(shí)，還要綜合紅外和化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），可以確定硫酸基在糖環(huán)上的取代位置［53，57］。 Liang 等［56］通過(guò)比較硫酸化前后多糖的13C NMR 圖譜信號(hào)特征，確定了取代位置發(fā)生在C-2 和C-6 上［59］，其中 C-2 被硫酸化后 C-2 的化學(xué)位移由 63.7 ppm 向低場(chǎng)移動(dòng)了3.3 ppm（為δ67.0 ppm），而且隨著DS 的增加，取代硫酸基團(tuán)的碳的電子環(huán)境變得復(fù)雜，信號(hào)的重疊越來(lái)越嚴(yán)重，所以?xún)H從13C NMR 譜圖確定取代位置還有很大的局限性。

3 展望

多糖的結(jié)構(gòu)決定了其功能，其中取代基團(tuán)的種類(lèi)、取代位置和數(shù)量（以取代度或含量表示）都是多糖重要的結(jié)構(gòu)參數(shù)，不僅影響其溶解度、分子量等理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，更重要的是能改變多糖的生物活性。很多研究表明，改性后的多糖產(chǎn)品已經(jīng)展現(xiàn)了廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抑菌等，特別是改性后的香菇多糖的抗病毒（HIV）活性在臨床上已經(jīng)成功應(yīng)用。因此，多糖的化學(xué)修飾是多糖藥物化學(xué)研究的一個(gè)重要分支，是提高天然多糖活性的一個(gè)重要途徑。因此，多糖的化學(xué)修飾具有廣闊的發(fā)展前景。

近幾年，多糖的化學(xué)修飾雖有了廣泛研究，但是尚顯不足。①目前的分離純化技術(shù)多糖制備效率不高，致使所得純品量少不足以衍生化和結(jié)構(gòu)分析，以后要加強(qiáng)分離純化工藝技術(shù)和流程的研究，提高純化效率，制備出更多的多糖純品。②多糖化學(xué)修飾方法的針對(duì)性、有效性和可控性還不夠高，應(yīng)該加強(qiáng)化學(xué)修飾方法和工藝條件的篩選與優(yōu)化，增加取代參數(shù)（如DS、取代位置）和分子量等方面的可控性。③目前多糖衍生化采用的先導(dǎo)化合物有些不是純品，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性不好，衍生產(chǎn)品的取代位點(diǎn)和數(shù)量不穩(wěn)定，以后應(yīng)盡量采用均一多糖作為衍生化的試驗(yàn)對(duì)象，提高試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。④目前工作主要集中在化學(xué)修飾方法的優(yōu)化和藥理活性的提高方面，改性后多糖的結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究報(bào)道不多，不利于分析和闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系。