高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測定地龍蛋白粉保健品中砷形態(tài)

王 穎 ，王 劍

（1.銀川能源學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，寧夏銀川7 5 001 0；2.寧夏食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)二站，寧夏銀川7 5 0001）

地龍蛋白粉取自地龍，越來越多應(yīng)用在心腦血管、內(nèi)分泌、呼吸系統(tǒng)等疾病的預(yù)防中，具有減少三高等很多的保健功能。結(jié)果表明，部分地龍蛋白粉中含有機(jī)砷量較少，但個(gè)別無機(jī)砷含量相對(duì)較高。

砷是一種在土壤中的有毒類金屬元素，砷的不同形態(tài)毒性也相差較大。以無機(jī)砷毒性最大，有機(jī)砷的毒性較弱[1]。目前所知的食藥材中以二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）、砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)等形式存在[2]。在主要的砷化物中，它們的毒性大小順序?yàn)锳s3+>As5+>MMA>DMA，而砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)被認(rèn)為是沒有毒性的[3]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已確認(rèn)無機(jī)砷及其化合物為人類I類致癌物[4]，地龍蛋白粉作為保健品，若砷含量超標(biāo)，則對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]。

本文總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，用高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)建立了蛋白粉中砷形態(tài)的分析方法，本方法相對(duì)準(zhǔn)確，為蛋白粉類的安全性評(píng)價(jià)提供了更加可靠的科學(xué)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

AFC-9750-LC-200液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀（北京海光儀器有限公司）、TG16-WS離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥8000r/min，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、MX-F固定式混勻儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）、KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、微孔濾膜（有機(jī)相）：0.45μm、C18小柱。

硝酸（GR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸、正己烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硼氫化鉀、氫氧化鈉（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（17.5±0.4μg/g，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（75.7±1.2μg/g，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（25.1±0.8μg/g，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（52.9±1.8μg/g，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；地龍蛋白粉（三個(gè)批次，來源于寧夏市場）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)中間液

砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液取用體積133.0μL定容體積10mL；亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液取用體積574.0μL定容體積10mL；一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液取用體積399.0μL定容體積10mL；二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液取用體積190.0μL定容體積10mL。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液

分別吸取As3+中間液、As5+中間液、MMA中間液與 DMA中間液各 0.25 mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、2.50mL于25 mL容量瓶配制出10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動(dòng)相定容，搖勻。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取1.0g（精確至0.001 g）試樣于50mL離心管中，加入20mL硝酸（0.05 mol/L）溶液，靜置過夜。于90℃恒溫箱中浸提2.5 h，每半小時(shí)取出混勻一次。取出，冷卻至室溫，離心15 min，轉(zhuǎn)速為8000r/min，取5 mL上清液置于離心管中，加入5 mL正己烷，振搖，靜置，棄去上層正己烷，正己烷洗滌2次，收集提取液，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)備凈化。

1.3.2 凈化

C18小柱使用前需進(jìn)行活化，依次用10mL甲醇、15 mL水通過，水完全流出后，上樣，棄去前2mL，收集流出的溶液，測定。

1.4 儀器參數(shù)設(shè)定

AFC-9750-LC-200液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀參數(shù)：陰離子交換柱（Hamilton PRP-X100，250×4.1mm，10μm）；保護(hù)柱（Hamilton PRP-X100，25mm×2.3mm，12～20μm）；流動(dòng)相（2mg/mL磷酸氫二鈉，6mg/mL磷酸二氫鉀）；進(jìn)樣體積：100μL；流速：1 mL/min；氫化物發(fā)生還原劑：35 g/L KBH4；載流：10%HCl；AFS條件空心陰極燈：高性能砷空心陰極燈，波長193.7 nm；元素?zé)鬉s；燈電流：80mA；光電倍增管負(fù)高壓：320V；原子化器高度：8 mm；載氣：氬氣，流速：300mL/min；屏蔽氣：氬氣，流速：900mL/min；蠕動(dòng)泵，轉(zhuǎn)速：60r/min。

2 儀器條件的優(yōu)化

分別對(duì)載流、還原劑和流動(dòng)相的濃度、光電倍增管負(fù)高壓等幾個(gè)因素進(jìn)行確定。設(shè)定條件為：還原劑濃度3.5%、流動(dòng)相比例50∶50、光電倍增管負(fù)高壓320V。

2.1 載流濃度

選取5%、7%、10%與15%濃度的鹽酸溶液。

圖1 載流的選擇

由圖1可知，增大載流濃度，峰面積逐漸增加。當(dāng)載流濃度為10%的時(shí)候，四種形態(tài)砷的分析結(jié)果達(dá)到最佳，故載流選擇10%的鹽酸溶液為實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 還原劑濃度

選取2.0%、3.0%、3.5%與4.0%濃度的硼氫化鉀溶液。

圖2 還原劑的選擇

由圖2可知，隨著還原劑增大三價(jià)砷的峰面積增大，二甲基砷峰面積影響時(shí)下時(shí)上，而一甲基砷和五價(jià)砷的濃度降低，改變還原劑濃度對(duì)峰面積影響沒有規(guī)律。通過對(duì)比譜圖基線發(fā)現(xiàn)還原劑濃度越低基線強(qiáng)度越高，并且基線嘈雜，對(duì)低濃度樣品檢測有較大的影響，而還原劑為4.0%時(shí)結(jié)果與3.5%時(shí)的結(jié)果差別很小。故本實(shí)驗(yàn)選取還原劑濃度為3.5%。

2.3 流動(dòng)相

選取磷酸氫二鈉溶液（2mg/mL）與磷酸二氫鉀（6mg/mL）溶液混合，體積比分別為30∶70、40∶60、50∶50和 60∶40。

由圖3可知，流動(dòng)相體積比為30∶70和40∶60時(shí)，出峰時(shí)間過長且檢測效果不好，在60∶40時(shí)，三價(jià)砷和二甲基砷的分離情況不好，兩個(gè)峰之間分離不開有拖尾且有雜峰，體積比為50∶50時(shí)，四個(gè)目標(biāo)峰的分離效果較好、分析時(shí)間較短，并且基線強(qiáng)度相比其他比例流動(dòng)相是最低的。故選擇流動(dòng)相比例為50∶50。

2.4 負(fù)高壓

選取280V、300V、320V和340V的光電倍增管負(fù)高壓。

由圖4可知，負(fù)高壓為280V和300V時(shí)，四種砷的檢測信號(hào)較低；負(fù)高壓為340V時(shí)，基線強(qiáng)度提高近一倍，影響了分析結(jié)果；負(fù)高壓320V時(shí)，對(duì)四種砷的檢測信號(hào)相對(duì)影響不大，故選擇320V的負(fù)高壓。

圖3 流動(dòng)相選擇譜圖

圖4 負(fù)高壓的選擇

3 方法學(xué)考察

3.1 重現(xiàn)性試驗(yàn)

兩人對(duì)同一試樣各做三組試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，兩人的RSD值均在0.00%～5.00%之間。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取1.0g地龍蛋白粉試樣一份，提取完畢后放置 1 h、2h、4h、6h、8 h 和 24h 進(jìn)行檢測。計(jì)算 RSD值，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性（見表2）。

由表2可知，在第10天一甲基砷RSD為6.16%。在第4天三價(jià)砷、五價(jià)砷、一甲基砷有下降趨勢，第6天五價(jià)砷的含量回升，有部分三價(jià)砷通過微生物的作用，轉(zhuǎn)化為五價(jià)砷。所以砷形態(tài)的穩(wěn)定性為3天，超過三天有機(jī)砷和無機(jī)砷將會(huì)互相轉(zhuǎn)化。

3.3 樣品加標(biāo)回收率

取已知樣品含量的樣品6份，添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，混均提取，測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，四種形態(tài)砷的回收率均在93.0%～101.0%之間，如表3所示。

由表3可知，四種形態(tài)砷的回收率均在93.0%～101.0%之間，RSD值在1.84%～3.69%之間。

3.4 精密度試驗(yàn)

精密度是指同一組數(shù)據(jù)彼此接近程度。對(duì)含有三價(jià)砷、二甲基砷、一甲基砷、五價(jià)砷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，算出RSD值（見表4）。

由表4可知，RSD為4.23%～5.04%之間。

3.5 最低檢出限和定量限

以三倍信噪比求得最低檢出限，十倍信噪比求得定量限，形態(tài)砷最低檢出限和定量限如表5所示。

4 樣品測定

分別對(duì)寧夏市場三個(gè)批次的地龍蛋白粉樣品進(jìn)行形態(tài)砷的含量檢測，測定結(jié)果見表6，國標(biāo)限度要求不得大于0.7 mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1#樣品三價(jià)砷、一甲基砷含量均高，砷總量超標(biāo)；2#、3#樣品砷總量合格，三種樣品均未檢出二甲基砷。

表1 重現(xiàn)性試驗(yàn)

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 精密度試驗(yàn)

表5 形態(tài)砷最低檢出限和定量限

5 結(jié)論

本文以高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測定地龍蛋白粉中不同形態(tài)的砷含量，通過對(duì)載流、還原劑和流動(dòng)相的濃度、光電倍增管負(fù)高壓等儀器進(jìn)行條件性實(shí)驗(yàn)，最終確立一定范圍內(nèi)最優(yōu)參數(shù)，建立了對(duì)地龍蛋白粉中四種砷形態(tài)分析的方法。結(jié)果表明，四種形態(tài)砷在10～100ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[6]，平均加標(biāo)回收率較好、最低檢出限較低。分別對(duì)寧夏市場三個(gè)批次的地龍蛋白粉樣品進(jìn)行形態(tài)砷的含量檢測，四種形態(tài)砷可同時(shí)測定，為相關(guān)部門對(duì)地龍蛋白粉的質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

表6 地龍蛋白粉中砷形態(tài)的檢測結(jié)果