蛋白酶對皮革降解性能的研究

趙寶寶，周裕仙，丁海燕，喬一凡，王全杰

（煙臺大學化學化工學院，山東煙臺264005）

皮革是很好的膠原蛋白來源，對廢棄皮革的有效利用，不但減少了我國每年產(chǎn)生的大量的各種革屑廢棄物，減小環(huán)境污染，而且回收利用得到的產(chǎn)品也可以銷售，為皮革行業(yè)再添一筆財富。對廢棄皮革的利用主要是通過對皮革進行不同程度的降解得到膠原蛋白，皮革的降解一般按照降解程度分為初級降解和最終降解。初級降解是指皮革內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化，皮革的特性功能喪失很大一部分，而最終降解是指皮革內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組成完全被破壞，蛋白質(zhì)等大分子被分解成CO2、H2O等小分子化合物，皮革的特性功能完全喪失。

皮革降解的過程事實上就是蛋白質(zhì)水解的過程。蛋白質(zhì)水解可得到變性蛋白、水溶蛋白、多肽及氨基酸[1-3]。蛋白質(zhì)的水解可以通過酸處理、堿處理、蛋白酶處理。其中蛋白酶處理有其它方法無可比擬的優(yōu)越性：反應(yīng)速度快，時間短，無環(huán)境污染，提取的水解膠原蛋白純度高，水溶性好，理化性質(zhì)穩(wěn)定，而且隨著生物技術(shù)水平的提高，酶制劑的來源廣泛，活性也不斷提高，價效比也大幅度降低，為其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了極大空間[4]。

蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解模式，可分為內(nèi)切和外切兩種模式。外切是指蛋白酶能夠從肽鏈的任一端切下單個氨基酸；內(nèi)切是指能夠與蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)部的肽鍵反應(yīng)，將大的肽鏈不斷剪斷成更小的肽鏈。蛋白酶水解膠原蛋白的作用機理十分復雜，影響因素較多，蛋白酶種類對膠原的水解程度有很大的影響[5]，不同的蛋白酶對不同的底物有不同的作用，反過來底物的結(jié)構(gòu)和組成也會影響酶的活力，不同的酶可將膠原分解為分子量不同的多肽或氨基酸。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均為肽鏈內(nèi)切酶，三種酶對肽鏈兩端的組成和結(jié)構(gòu)是有一定要求的，并不是對所有肽鍵有作用，只有肽鍵兩邊或一邊有特定氨基酸時，蛋白酶才會對肽鏈起作用。不同的酶可能還會有抑制作用，影響酶的活力，降低蛋白酶的作用效果，造成不必要的損失。

本課題主要通過蛋白酶降解皮革的實驗，重點考察和探究胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶三種酶對膦鞣革、無鉻鞣革、鉻鞣革三種皮革的降解效果，通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，優(yōu)化酶的降解條件。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

膦鞣坯革（工業(yè)品，浙江明新旭騰皮業(yè)有限公司）；無鉻鞣坯革（工業(yè)品，浙江明新旭騰皮業(yè)有限公司）；鉻鞣坯革（工業(yè)品，浙江明新旭騰皮業(yè)有限公司）；胰蛋白酶（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；木瓜蛋白酶（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；堿性蛋白酶（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；四硼酸鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；L-酪氨酸（分析純，上海藍季科技發(fā)展有限公司）；三氯乙酸（分析純，天津市光復精細化工研究所）；干酪素（分析純，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）；檸檬酸（分析純，天津市瑞金特化學品有限公司）；結(jié)晶乙酸鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；鹽酸（分析純，煙臺三和化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市瑞金特化學品有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫鈉（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；福林試劑（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸鈉（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸銅（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；酒石酸鉀鈉（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）。

752紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海右一儀器有限公司）；Phs-3D功能型pH計（上海三信儀表廠）；恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 蛋白酶的種類優(yōu)化

1.2.1 酶活力的測定

1.2.1.1 繪制酪氨酸-吸光度標準曲線

（1）標準液的配制

取 5 個試管分別標號為 1、2、3、4、5，向其中分別加入 1、2、3、4、5 mL 100μg/mL 酪氨酸溶液，再分別向其中加入 9、8、7、6、5 mL 蒸餾水，最后可得酪氨酸實際濃度分別為 10、20、30、40、50μg/mL。

（2）對標準溶液反應(yīng)顯色

取2個試管分別標記為A和B，A為空白對照，B為標準試樣。用1 mL移液管移取1.0mL蒸餾水，標記為A；用1 mL移液管移取1.0mL標準液，標記為B。加5.0mL的0.4moL/L碳酸鈉溶液，再向其中加入1 mL福林試劑，在40℃恒溫水浴25 min，最后在680nm測吸光度。

1.2.1.2 測定蛋白酶活力

（1）反應(yīng)顯色

取2個試管分別標記為A和B，A為空白對照，B為酶樣。在試管A中，加蒸餾水1.0mL，在40℃，預熱5 min，加0.4moL/L三氯乙酸2.0mL，搖勻；40℃，保溫 10min；加 10.00mg/mL 酪素 1.0mL，搖勻；靜置15 min，過濾；取1.0mL濾液，加0.4moL/L碳酸鈉5.0mL，再向其中加入1 mL福林試劑，在40℃恒溫水浴25 min，最后在680nm測吸光度。在試管B中，加酶樣 1.0mL，在 40℃，預熱 5 min，加10mg/mL 酪素 1.0mL，搖勻；40℃，保溫 10min，加0.4moL/L三氯乙酸2.0mL，搖勻，取出靜置15 min，過濾，取1.0mL濾液，加0.4moL/L碳酸鈉5.0mL，加福林試劑使用液1.00mL，在40℃恒溫水浴25 min，最后在680nm測吸光度。

（2）計算酶的活性

式中：A——樣品吸光度

K——吸光度常數(shù)

4——反應(yīng)試劑的總體積（mL)

10——酶解反應(yīng)時間（min）

N——酶樣稀釋總倍數(shù)

其中，吸光度常數(shù)等于A=1時酪氨酸的量的數(shù)值。

1.2.2 不同種類蛋白酶對皮革的降解率

1.2.2.1 實驗方案

稱取適量已烘干的鉻鞣革、膦鞣革、無鉻鞣革分別加入盛有酶液的250mL碘量瓶中，并記錄皮革質(zhì)量。設(shè)置水浴振蕩器溫度為40℃，將已加入皮革的蛋白酶溶液放入水浴振蕩器中，震蕩反應(yīng)4h。將反應(yīng)后的皮革烘干稱其質(zhì)量，留取反應(yīng)后的溶液測其蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 皮革降解率的計算

式中：M0——皮革降解前的質(zhì)量（g）

M1——皮革降解后的質(zhì)量（g）

1.2.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測定

（1）配制標準蛋白質(zhì)溶液

取 7個試管分別標號為 1、2、3、4、5、6、7，向其中分別加入0、1、2、4、6、8、10mL 2.0mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液，再向其中分別加入1、9、8、6、4、2、0mL蒸餾水，最后可得濃度為 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。

（2）測定蛋白質(zhì)濃度

取2個試管分別標記為1、2，1為空白管，2為樣品管。向其中分別加入0、1 mL樣品，再向其中加入1、0mL蒸餾水，分別加入5 mL試劑A搖勻，室溫放置10min，再分別加入0.5 mL試劑B迅速搖勻，30℃恒溫水浴30min，640nm測吸光度。

將等體積的4%碳酸鈉溶液和0.2moL/L氫氧化鈉溶液混合，1%硫酸銅溶液和2%酒石酸鉀鈉溶液等體積混合，然后將混合后的兩種溶液按50∶1（體積比）混合搖勻，即為試劑A。試劑B為福林試劑。

1.3 蛋白酶水解條件的優(yōu)化

1.3.1 濃度優(yōu)化

在溫度、pH等相同條件下，配置5 g/L、10g/L、15 g/L、20g/L、30g/L、40g/L 的蛋白酶溶液，反應(yīng) 4h，對不同方法鞣制的坯革進行降解實驗，以三種坯革的降解率和降解液中蛋白質(zhì)的含量變化趨勢為指標，確定蛋白酶的最佳濃度。

1.3.2 反應(yīng)時間優(yōu)化

在溫度、pH等相同條件下，配置最優(yōu)濃度的酶液，反應(yīng)不同時間，對三種不同方法鞣制的坯革進行降解實驗，以三種坯革的降解率為指標確定最佳反應(yīng)時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶活力測定結(jié)果

2.1.1 吸光度常數(shù)的確定

圖1 酪氨酸標準曲線圖Fig.1 Standard graph of tyrosine

其中吸光度常數(shù)K=113.4。

2.1.2 蛋白酶活力的測定

表1 三種蛋白酶的活力Tab.1 The activity of three proteases

表1是三種蛋白酶的活力結(jié)果，由表可知，堿性蛋白酶的活力最高，胰蛋白酶其次，木瓜蛋白酶的活力最小。

2.2 蛋白酶種類優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 皮革降解率的比較

表2 同濃度蛋白酶溶液對不同皮革的降解率Tab.2Degradation rates of protease solution with the same concentration to different leather

圖2不同種類蛋白酶對不同鞣制方法成革降解率的影響Fig.2Effects of different proteases on degradation rates of leather by different tanning methods

圖2 是不同種類蛋白酶對不同鞣制方法成革降解率的影響，由圖可知，堿性蛋白酶對三種皮革的降解效果最好，木瓜蛋白酶其次、胰蛋白酶最差，故堿性蛋白酶為最適蛋白酶。其中，從降解效果來看，降解效果最好的是膦鞣革，其次是無鉻鞣革，最差的是鉻鞣革。從三種酶的降解效果來看，鉻鞣革最難降解，這主要是由于鉻鞣革中的鉻離子與蛋白酶能夠發(fā)生一定程度的結(jié)合，從而使蛋白酶的活力下降甚至失活，削弱了蛋白酶的降解效果。另外，鉻鞣革中，鉻與膠原蛋白質(zhì)的結(jié)合最牢固，蛋白酶對膠原大分子的水解難度加大。從實驗結(jié)果來看，蛋白酶的活力大小，并不完全決定對皮革的降解效果。從表2可以看出，盡管胰蛋白酶的活力比木瓜蛋白酶的活力要高，但胰蛋白酶對三種皮革的降解效果并沒有木瓜蛋白酶的好。這一方面與蛋白酶的作用專一性有關(guān)，另外一方面，由于蛋白酶的分子量并不相同，相對而言，小分子量的蛋白酶更容易進入底物內(nèi)部，與底物充分接觸，使其降解，因此，在對皮革的降解處理中，蛋白酶降解底物的不同，降解效果不同。

2.2.2 最佳蛋白質(zhì)濃度的確定

（1）蛋白質(zhì)標準曲線

表3 蛋白質(zhì)標準液測定結(jié)果Tab.3 Determination results of protein standard solution

圖3 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.3 Protein standard curve

（2）蛋白質(zhì)濃度

表4 同濃度酶液降解液中蛋白質(zhì)濃度Tab.4Protein concentrations in the degradation solution with the same concentration of enzyme

圖4 不同酶對降解液中蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.4Effects of different enzymes on protein concentration in the degradation solution

圖4 是不同酶對降解液中蛋白質(zhì)濃度的影響，由圖可知，對三種皮革而言，同濃度下堿性蛋白酶降解液中蛋白質(zhì)濃度最高、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶降解液中蛋白質(zhì)濃度較小。

對三種皮革而言，同種酶對降解液中蛋白質(zhì)的濃度的影響也不同，膦鞣革中的蛋白質(zhì)濃度最高，無鉻鞣革和鉻鞣革依次減小。這主要是由于三種皮革不同的鞣制方法決定的，鉻鞣劑與膠原結(jié)合最好，所以鉻鞣革難以降解；無鉻鞣革是采用植物和醛類結(jié)合鞣制而成，其中的丹寧成分能夠阻止降解；膦鞣是有機物，所以最容易降解，因此溶液里面蛋白含量高。

2.3 堿性蛋白酶濃度優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 皮革降解率變化趨勢

圖5 堿性蛋白酶濃度對皮革降解率的影響Fig.5 Influence of alkaline protease concentration on leather degradation rate

圖5 是堿性蛋白酶濃度對皮革降解率的影響，由圖可知，隨著堿性蛋白酶濃度的增加，三種皮革的降解率均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，堿性蛋白酶在15 g/L時，三種皮革的降解率較高，鉻鞣革可達到4.57%，無鉻鞣革26.38%，膦鞣革36.59%。三種皮革的降解率仍然是膦鞣革最大，無鉻鞣革其次，鉻鞣革最小，且鉻鞣革的降解率變化很小?？梢钥闯觯笣舛鹊奶岣卟]有提高皮革的降解率，反而有所下降，這可以從酶促反應(yīng)動力學的角度解釋，堿性蛋白酶濃度較低時，皮革的降解速率與堿性蛋白酶的濃度成正比，隨著堿性蛋白酶濃度的增加，三種皮革的降解速率亦增大；但是當堿性蛋白酶濃度過高時，則會產(chǎn)生反作用，堿性蛋白酶之間會相互抑制，致使酶的活力下降，皮革的降解速率降低。另外，對于鉻鞣革而言，降解過程中不斷會有鉻離子脫落出來，而鉻離子也可能會抑制酶的活力，造成鉻鞣革的降解速率嚴重下降，而這一影響因素也是導致鉻鞣革的降解率遠比膦鞣革、無鉻鞣革的降解率低的主要原因。

2.3.2 蛋白質(zhì)濃度變化趨勢

圖6 堿性蛋白酶濃度對降解液中蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.6 Effect of alkaline protease concentration on protein concentration in degradation solution

表5 不同濃度堿性蛋白酶對不同皮革的降解率Tab.5 Degradation rates of different concentrations of alkaline proteases to different leather

表6 不同濃度堿性蛋白酶降解液中蛋白濃度Tab.6 Protein concentrations in alkaline protease degradation solution at different concentrations

圖6是酶濃度對水解液中蛋白質(zhì)濃度的影響，由圖可知，隨著堿性蛋白酶濃度的提高，水解蛋白質(zhì)濃度也不斷提高，不過在酶濃度20g/L出現(xiàn)拐點，其后盡管酶濃度不斷提高，但水解蛋白質(zhì)濃度增速緩慢。三種皮革的水解蛋白質(zhì)濃度仍然是膦鞣革最高，無鉻鞣革其次，鉻鞣革最小?？梢钥闯?，一定程度上，隨著酶濃度的提高，膠原蛋白的降解程度不斷加大。

2.4 堿性蛋白酶降解時間優(yōu)化結(jié)果

表7 不同時間下三種皮革的降解率Tab.7 Degradation rates of the three kinds of leather at different times

圖7 時間對皮革降解的影響Fig.7 Effects of time on leather degradation

圖7 是時間對皮革降解的影響，由圖可知，隨著降解時間的增加，三種皮革的降解率均提高，且仍然是膦鞣革最高，無鉻鞣革其次，鉻鞣革最低。其中在6h時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，此后隨著反應(yīng)時間的增加，三種皮革的降解率雖然仍在增加，但已變得較為緩慢。這可能是由于隨著時間的增加，堿性蛋白酶的活性逐漸降低甚至失活。

3 結(jié)論

通過堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對鉻鞣坯革、無鉻鞣坯革、膦鞣坯革的降解實驗發(fā)現(xiàn)，三種蛋白酶中堿性蛋白酶對三種皮革的降解效果最好，木瓜蛋白酶次之，胰蛋白酶最差；對皮革種類而言，膦鞣革的降解效果最好，無鉻鞣革次之，鉻鞣革最差。

通過對堿性蛋白酶降解皮革的條件進一步探索，發(fā)現(xiàn)當堿性蛋白酶濃度為15 g/L，40℃恒溫水浴震蕩6h，鉻鞣革降解率可達到4.52%，無鉻鞣革降解率可達到27.44%，膦鞣革降解率可達到36.76%。