基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究小柴胡湯治療肝癌的機(jī)制

錢曉濤，張媛媛

肝癌是中國(guó)第二大常見癌癥，是致命的癌癥之一。中國(guó)每年約有38.3萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的51%，嚴(yán)重影響人們的健康甚至危及生命[1]。中醫(yī)藥在肝癌內(nèi)科治療方面有著確切的療效,并且中醫(yī)獨(dú)特的理論體系和辨證論治原則可以使治療更加個(gè)體化[2]。小柴胡湯由柴胡、黃芩、半夏、生姜、人參、大棗、甘草7味中藥組成。其中柴胡、黃芩泄少陽(yáng)郁熱；半夏、生姜辛散，可顧護(hù)腸胃同時(shí)疏散氣郁；人參、大棗益氣扶正；甘草調(diào)中；全方具有和解少陽(yáng)、調(diào)暢三焦氣機(jī)的功效[3]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選小柴胡湯的主要活性成分及作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)，并進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，有助于尋找治療肝癌的新途徑。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[4](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，得到柴胡、黃芩、半夏、甘草、人參、生姜、大棗的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件。

1.2 靶標(biāo)蛋白基因名的確定 使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[5]中的UniProKB檢索功能(https://www.uniprot.org/)，查詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，并限定物種為“Homo sapiens”，將查詢得到的靶點(diǎn)蛋白信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 肝癌的靶點(diǎn)篩選 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[6](https://genealacart.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[7](https://www.omim.org/)，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 小柴胡湯治療肝癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將小柴胡湯和肝癌的靶點(diǎn)上傳至在線作圖工具Venny 2.1，繪制韋恩圖(見圖1)，得到中藥藥對(duì)活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)，然后利用Cytoscape軟件(V3.7.1)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，得到活性成分-交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。其中節(jié)點(diǎn)的類型有活性成分、靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 藥物對(duì)疾病治療的效應(yīng)最終表現(xiàn)在蛋白相互作用上。運(yùn)用韋恩圖(Venn diagram)得到活性成分靶點(diǎn)與肝癌靶點(diǎn)的交集基因，導(dǎo)入STRING11.0(http://www.string-db.org/)，隱藏離散的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，得到交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用關(guān)系。

1.6 GO和KEGG富集分析 將1.4得到的活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)利用R語(yǔ)言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行處理，得到GO功能富集分析(圖4A、4B、4C)和KEGG通路富集分析(圖5)，設(shè)定閾值P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用分子對(duì)接技術(shù)研究小柴胡湯的活性成分及其治療肝癌的相關(guān)靶點(diǎn)，能夠在一定程度上說(shuō)明活性成分與靶點(diǎn)蛋白的作用機(jī)制與結(jié)合活性[8]。從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1(PDB ID:4GV1)、ALB(PDB ID:1N5U)、JUN(PDB ID:2G01)、MYC(PDB ID:1EE4)、VEGFA(PDB ID:1MKK)、IL6(PDB ID:1N26)的PDB格式，從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵活性成分槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素sdf格式的3D結(jié)構(gòu)。采用Autodock Tools 1.5.6中的Edit模塊對(duì)蛋白進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、添加原子類型等操作，采用Torsion Tree模塊判定配體的root并選擇配體可扭轉(zhuǎn)的鍵，完成后導(dǎo)出pdbqt格式的受體蛋白和小分子，采用Autodock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，采用Discovery Studio2020可視化分析對(duì)接構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)的篩選 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中小柴胡湯所有成分及相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)篩選出的靶點(diǎn)添加基因名。根據(jù)OB和DL對(duì)小柴胡湯中的活性成分進(jìn)行篩選，分別得到柴胡活性成分17個(gè)、黃芩活性成分36個(gè)、半夏活性成分13個(gè)、甘草活性成分92個(gè)、人參活性成分22個(gè)、生姜活性成分5個(gè)、大棗活性成分29個(gè)。

2.2 肝癌的靶點(diǎn)篩選 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)1 004個(gè)，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)495個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，共得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 404個(gè)。

2.3 小柴胡湯-肝癌靶標(biāo)的構(gòu)建 利用在線作圖工具Venny 2.1，輸入小柴胡湯活性成分靶點(diǎn)258個(gè)和肝癌疾病靶點(diǎn)1 402個(gè)，兩者取交集后得到127個(gè)交集靶點(diǎn)(見圖1)。

圖1 小柴胡湯與肝癌靶點(diǎn)

2.4 化合物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包括135個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，279個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)以及1 378條邊構(gòu)成。拓?fù)浣Y(jié)果顯示，“degree”值較高的成分是槲皮素(quercetin，MOL000098)，山奈酚(kaempferol，MOL000422)，漢黃芩素(wogonin，MOL000173)，柚皮素(naringenin，MOL004328)，β-胡蘿卜素(beta-carotene，MOL002773)，黃芩素(baicalein，MOL002714)等，小柴胡湯主要通過(guò)135個(gè)活性成分作用于127個(gè)靶標(biāo)基因，這127個(gè)靶標(biāo)基因可能影響肝癌的發(fā)生。

圖2 化合物-活性成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 在STRING v11.0數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度“Medium confidence”為0.4，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中“degree”值較高的靶點(diǎn)是AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6等，提示這些靶點(diǎn)可能是小柴胡湯治療肝癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.6 GO功能富集分析 將上述得到的127個(gè)交集靶點(diǎn)通過(guò)R語(yǔ)言的Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行GO功能富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過(guò)程(biological process，BP)(圖4A)，細(xì)胞組分(cellular component，CC)(圖4B)和分子功能(molecular function ，MF)(圖4C)三部分。

2.7 KEGG通路富集分析 通過(guò)R語(yǔ)言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行KEGG通路富集分析后，富集比較明顯的前20個(gè)通路(圖5)包括：PI3K-Akt信號(hào)通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、凋亡、IL-17信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。

圖3 小柴胡湯治療肝癌的PPI網(wǎng)絡(luò)

4A 生物過(guò)程

4B 細(xì)胞組分

4C 分子功能圖4 GO功能富集分析結(jié)果

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.8 核心成分的分子對(duì)接驗(yàn)證 一般認(rèn)為結(jié)合能越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，≤-5.0 kcal/mol說(shuō)明兩者可以結(jié)合，≤-7.0 kcal/mol說(shuō)明兩者有較好的結(jié)合能力[9]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素與AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6有較好的結(jié)合能力。

2.9 分子對(duì)接結(jié)合模式分析 a、b環(huán)均與Asp292、Glu191形成π-陰離子作用；c環(huán)與Leu295形成π-sigma作用，其酚羥基與Lys276、Asp274形成氫鍵作用, 見圖6-1(B)2D作用圖和圖6-1(C)3D作用圖。a環(huán)與Val164形成π-sigma作用；c環(huán)與Val164、Ala177、Ala230形成疏水作用，與Met281形成硫-π作用, 見圖6-2(B)2D作用圖和圖6-2(C)3D作用圖。a環(huán)與Tyr138、Tyr161形成π-π堆積作用；b環(huán)與Tyr138形成酰胺-π堆積作用，與Tyr161形成π-π堆積作用，與Ile142形成疏水作用，其羥基與Leu135形成氫鍵作用；c環(huán)與Tyr161、Phe157形成π-π堆積作用，與Ile142形成疏水作用, 見圖6-3(B)2D作用圖和圖6-3(C)3D作用圖。a環(huán)與Val158、Ile32形成疏水作用，與Met111、Asn114形成氫鍵作用；b環(huán)與Val158、Ile32、Ala53、Val40形成疏水作用，其羰基與Met111、Leu110形成氫鍵作用；c環(huán)與Met108形成硫-π作用，與Val40、Lys55形成疏水作用，見圖6-4(B)2D作用圖和圖6-4(C)3D作用圖。a、b環(huán)均與Trp195形成π-π間環(huán)堆積效應(yīng)；b環(huán)羥基與Ser230形成氫鍵作用；c環(huán)與Glu191形成π-陰離子作用，其酚羥基與Glu192形成氫鍵作用，見圖6-5(B)2D作用圖和圖6-5(C)3D作用圖。a環(huán)與Leu149形成疏水作用；b、c環(huán)均與Glu191形成π-陰離子作用；c環(huán)酚羥基與Ser230形成氫鍵作用，見圖6-6(B)2D作用圖和圖6-6(C)3D作用圖。a環(huán)與Met94形成硫-π作用，與Arg82形成π-陽(yáng)離子作用，與Gly92形成氫鍵作用；b環(huán)與Met94形成疏水作用，與Glu42形成π-陰離子作用；c環(huán)與Met94形成疏水作用，與Ser95、Tyr39形成氫鍵作用，見圖6-7(B)2D作用圖和圖6-7(C)3D作用圖。a環(huán)與Pro121、Pro117、Pro95形成疏水作用，與Thr120形成酰胺-π堆積作用，與Glu96形成氫鍵作用；b環(huán)與Val93形成π-sigma作用；c環(huán)與Val93形成疏水作用, 見圖6-8(B)2D作用圖和圖6-8(C)3D作用圖。

圖6-1 槲皮素與AKT1相互作用圖

圖6-2 柚皮素與AKT1相互作用圖

圖6-3 山奈酚與ALB相互作用圖

圖6-4 漢黃芩素與JUN相互作用圖

圖6-6 黃芩素與MYC相互作用圖

圖6-7 槲皮素與VEGFA相互作用圖

圖6-8 漢黃芩素與IL6相互作用圖

3 討論

本資料通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建方中活性成分與肝癌交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，推測(cè)槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素等可能是本方發(fā)揮作用的重要成分。分子對(duì)接提示，核心成分與肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL-6之間均表現(xiàn)出了良好的對(duì)接活性。

槲皮素抑制了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使肝癌細(xì)胞惡性程度降低，防止了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[10]。山奈酚可以明顯抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，經(jīng)山奈酚處理的人肝癌Huh7細(xì)胞,細(xì)胞凋亡特征明顯,且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞凋亡率逐步增高[11]。馮永波等[12]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖, 具有明顯的抗腫瘤效果。通過(guò)Western Blot法檢測(cè)了漢黃芩素作用前后人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表達(dá)水平的變化,漢黃芩素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制是通過(guò)線粒體信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[13]。柚皮素是食物中常見的類黃酮物質(zhì)，研究[14]發(fā)現(xiàn)柚皮素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒作用。流行病學(xué)研究[15]表明，在膳食中補(bǔ)充富含β-胡蘿卜素或類胡蘿卜素果蔬，可以使各種惡性腫瘤的發(fā)生率較低。黃芩素能下調(diào)肝癌干細(xì)胞中誘捕受體3的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移這一系列生物學(xué)行為[16]。

研究[17]表明，AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān),突變基因型(GT+TT)可能是原發(fā)性肝癌的易感基因。肝細(xì)胞癌患者常伴有肝臟功能異常以及伴隨的患者整體的營(yíng)養(yǎng)消耗[18]。張穎超等[19]研究結(jié)果顯示, c-fos和c-jun在正常肝組織中只有低水平表達(dá)或不表達(dá), 而在癌旁異型增生肝組織中均有表達(dá),提示c-fos和c-jun的異常表達(dá)可能與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，而使c-fos和c-jun滅活或下調(diào)其表達(dá)水平可能成為預(yù)防和治療HCC的一種新方法。謝斐[20]首次發(fā)現(xiàn)miR-320a在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中可以抑制靶基因c-Myc的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制c-Myc可以抑制肝癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力。在肝癌細(xì)胞系BEL-7402 中，miR-195 能夠打靶腫瘤血管生成相關(guān)蛋白 FGF2和VEGFA[21]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)，是最重要的促血管生成介質(zhì)之一，直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并激活 PI3K、ERK 及 AKT 等信號(hào)傳導(dǎo)通路，與肝臟惡性腫瘤的發(fā)生及預(yù)后有著密切的關(guān)系[22]。冀彤[23]發(fā)現(xiàn)IL-6通過(guò)調(diào)控NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。杜忠良等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和VEGF的表達(dá)可能與PI3K/AKT通路被抑制相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞應(yīng)答各種應(yīng)激的不同反應(yīng)密切相關(guān)。長(zhǎng)期性的病毒感染、負(fù)面精神情緒、不良生活行為等形成的慢性應(yīng)激,往往促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[25]。在癌癥中，氧化應(yīng)激水平通常會(huì)增加，肝癌細(xì)胞的高增殖能力和持續(xù)性炎癥，都與氧化應(yīng)激有關(guān)。氧化應(yīng)激一方面直接在DNA上形成8-oxo G或脂質(zhì)過(guò)氧化引起畸變，另一方面通過(guò)表觀遺傳機(jī)制促進(jìn)肝癌發(fā)生[26]。研究[27]表明在營(yíng)養(yǎng)成分如葡萄糖缺乏的條件下，肝癌細(xì)胞從糖酵解途徑產(chǎn)生的ATP減少，為了維持ATP的穩(wěn)態(tài)，肝癌細(xì)胞通過(guò)動(dòng)員甘油三酯，經(jīng)過(guò)脂肪分解產(chǎn)生ATP滿足自身需要，從而抵抗應(yīng)激反應(yīng)。

研究[28]證實(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路可以抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。流行病學(xué)研究[29]表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黃曲霉素、飲水污染、酒精、肝硬化、亞硝胺類物質(zhì)、微量元素等都與肝癌發(fā)病相關(guān)。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起肝細(xì)胞癌(HCC)的主要原因。在世界上HCC發(fā)病率最高的國(guó)家如中國(guó)、韓國(guó)等，發(fā)現(xiàn)HBV和HCV陽(yáng)性的比例均很高[30]。

由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法尚存在一定的局限性，本資料旨在為后期進(jìn)一步探討小柴胡湯治療肝癌的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。