棗幼胚培養(yǎng)畸形苗發(fā)生影響因素的研究

任海燕 李登科 王永康 趙愛(ài)玲 薛曉芳 弓桂花 李毅

摘?要：以‘冷白玉30 d胚齡的幼胚為材料，對(duì)影響胚發(fā)育的外源激素、放置方式、胚乳看護(hù)時(shí)間、光照條件、低溫處理的效果進(jìn)行了研究，以期降低畸形苗發(fā)生率，提高幼胚培養(yǎng)效率。結(jié)果表明，在IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素條件下，可獲得較高的成胚率56.82%;合點(diǎn)端插入培養(yǎng)基的豎放方式可顯著促進(jìn)幼胚生長(zhǎng)發(fā)育，幼胚萌發(fā)率可達(dá)77.39%;胚乳看護(hù)適宜時(shí)間45 d較為適宜;暗培養(yǎng)利于幼胚正常發(fā)育;接種前幼果進(jìn)行低溫處理對(duì)減緩畸形苗發(fā)生的影響較小。

關(guān)鍵詞：棗;幼胚;培養(yǎng)

文章編號(hào)：2096-8108（2021）01-0011-03?中圖分類號(hào)：S665.1?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Young embryos （30-day-old） of Chinese jujube （ Ziziphus?jujuba‘Lengbaiyu） were selected as materials. The factors influencing the rescue of the young embryos， including hormones， placement， endosperm care time， light conditions and low temperature were studied in order to reduce the incidence of abnormal seeding and increase the young embryo culture efficiency. The culture condition was optimized as follows：， a higher embryo formation rate of 56.82% could be obtained using the hormones of IBA 0.8 mg/L +ZT 0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L;the germination rate of immature embryos could reach 77.39% by putting the chalazal end of embryo into culture medium （radical end up ）. The appropriate time of endosperm care was 45 days and immature embryos developed normally under the dark condition. 0～4 ℃ low temperature before inoculation had little effect on slowing down the occurrence of deformed seedlings.

Keywords：Chinese jujube;immature embryos;culture

棗胚早期敗育問(wèn)題嚴(yán)重是制約棗雜交育種進(jìn)程的重大難題，胚培養(yǎng)是克服棗早期敗育的有效方法。然而胚培養(yǎng)過(guò)程中高頻率的畸形苗現(xiàn)象，成為制約該項(xiàng)育種技術(shù)開展的主要瓶頸。祁業(yè)鳳等[1]將棗幼胚接種后，多數(shù)形成畸形苗，表現(xiàn)為子葉間小葉不斷增生的蓮座狀。段乃彬等[2]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期的幼胚經(jīng)培養(yǎng)后形成卷曲的片狀結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)不斷增生現(xiàn)象，不能產(chǎn)生根和莖，致使幼胚不能發(fā)育為植株?？梢?jiàn)畸形苗發(fā)生的比例成為影響棗幼胚育種效率的重要因素之一。

Leshem[3]指出畸形苗是生長(zhǎng)因子不平衡的產(chǎn)物，適宜的胚挽救條件是預(yù)防或減少畸形苗發(fā)生率的重要環(huán)節(jié)。目前，針對(duì)無(wú)核葡萄胚挽救過(guò)程中出現(xiàn)畸形苗的成因和培養(yǎng)條件已做了大量的研究[4，5]，接種前對(duì)葡萄幼果進(jìn)行4 ℃低溫處理20 d，可有效減少畸形苗的發(fā)生。通過(guò)調(diào)整激素的種類和濃度來(lái)控制葡萄畸形胚的發(fā)生取得了明顯的效果[6]。同樣，研究表明[7，8]，在棗幼胚培養(yǎng)過(guò)程中添加適宜的外源激素對(duì)幼胚發(fā)育有促進(jìn)作用。關(guān)于棗胚培養(yǎng)過(guò)程中降低畸形苗發(fā)生率的研究鮮有報(bào)道。因此，為提高棗幼胚培養(yǎng)效率，預(yù)防或減少畸形苗的發(fā)生率，我們開展了以‘冷白玉30 d胚齡的幼胚為材料，對(duì)影響胚發(fā)育的激素、放置方式、胚乳看護(hù)時(shí)間、光照條件、低溫的效果進(jìn)行了研究，為提高棗幼胚培養(yǎng)效率奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

試材‘冷白玉采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家棗資源圃。

具體可參照棗定花定果方法[8]。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?不同激素配比對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，激素IBA0.2～0.8 mg/L、ZT0.5～1.5 mg/L、GA33.0～7.0 mg/L、NAA0.1～0.3 mg/L，研究不同激素配比對(duì)幼胚發(fā)育的影響，成胚率（%）=可見(jiàn)胚數(shù)或胚沿胚性生長(zhǎng)數(shù)/接種胚數(shù)×100%。

1.2.2?不同放置方式對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響

將每個(gè)組合的胚按照完全浸于培養(yǎng)基的平放方式和胚合點(diǎn)端插入培養(yǎng)基的豎放方式進(jìn)行接種，研究不同放置方式對(duì)幼胚萌發(fā)的影響。

1.2.3?胚乳看護(hù)時(shí)間

將棗幼胚接種在相同培養(yǎng)基MS+IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+LH 500 mg/L+蔗糖7%中，分別為胚乳看護(hù)15 d、30 d、45 d后，研究不同胚乳看護(hù)時(shí)間對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響，調(diào)查幼胚萌發(fā)率。

1.2.4?光照條件

將接種在培養(yǎng)基的幼胚，分別置于光照條件和黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后調(diào)查幼胚發(fā)育情況。

1.2.5?低溫處理

接種前將幼果進(jìn)行0～4 ℃低溫處理，并設(shè)置天數(shù)0 d、20 d、40 d、60 d。經(jīng)低溫處理的幼果消毒后在超凈工作臺(tái)上取出幼胚，接種于MS培養(yǎng)基中，附加蔗糖設(shè)7%，30 d后調(diào)查幼胚發(fā)育情況，研究低溫處理對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同激素配比對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響

外源激素與內(nèi)源激素共同作用影響畸形苗的發(fā)生，激素因素是影響畸形苗的主要研究?jī)?nèi)容[10，11]。添加適宜種類和濃度的外源激素，對(duì)于胚發(fā)育可以起到促進(jìn)的作用。結(jié)果表明，不同激素配比對(duì)冷白玉不同胚齡幼胚影響的試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），幼胚在IBA0.8 mg/L+ZT1.5 mg/L+GA35.0 mg/L+NAA0.1 mg/L時(shí)，幼胚獲得成胚率最低，僅為38.40%。添加在處理1和處理4的激素條件下，成胚率分別為56.82%、54.51%，顯著高于其他處理。可見(jiàn)，IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素條件下，成胚率為56.82%，可以使幼胚沿胚性生長(zhǎng)，獲得較高的成胚率。

2.2?不同放置方式對(duì)胚培養(yǎng)效果的影響

由表2可知，不同放置方式對(duì)幼胚萌發(fā)率的影響存在顯著差異。幼胚平放處理時(shí)平均萌發(fā)率為34.12%，畸形苗率為36.27%。而豎放時(shí)萌發(fā)率可達(dá)70.54%，畸形苗發(fā)生率較低為19.31%?？梢?jiàn)，胚珠合點(diǎn)端插入培養(yǎng)基的豎放方式可顯著促進(jìn)幼胚生長(zhǎng)發(fā)育。這一研究結(jié)果與梁春莉等[12]在對(duì)冬棗挽救技術(shù)中的結(jié)果一致。

2.3?胚乳看護(hù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幼胚發(fā)育的影響

由表3可知，30 d胚齡的幼胚經(jīng)胚乳看護(hù)15 d后，多數(shù)幼胚肉眼不可見(jiàn)，幼胚發(fā)育率調(diào)查困難。當(dāng)幼胚經(jīng)胚乳看護(hù)30 d后，幼胚發(fā)育率達(dá)59.38%，胚乳逐漸由透明色轉(zhuǎn)為乳白色，幼胚發(fā)育為子葉形胚，但幼胚子葉較小，此時(shí)轉(zhuǎn)接不易于幼胚沿胚性生長(zhǎng)成苗。培養(yǎng)45 d時(shí)，雖然發(fā)育率為56.82%，但子葉形胚充滿種仁的2/3，幼胚發(fā)育相對(duì)完整，易于幼胚后期萌發(fā)成苗?？梢?jiàn)，胚乳看護(hù)45 d較為適宜，可減少畸形苗的發(fā)生，利于幼胚沿胚性生長(zhǎng)。

在棗幼胚培養(yǎng)過(guò)程中，并非經(jīng)胚乳看護(hù)胚培養(yǎng)獲得的全部胚都能正常生長(zhǎng)，有的因培養(yǎng)條件不適宜則形成畸形苗。有報(bào)道[9]認(rèn)為，畸形苗的發(fā)生可能與胚的發(fā)育程度有關(guān)。本研究結(jié)果表明，幼胚經(jīng)胚乳看護(hù)培養(yǎng)45 d后，多數(shù)幼胚發(fā)育為子葉形胚，易于幼胚正常發(fā)育，有效減少了畸形苗的發(fā)生。

2.4?光照條件對(duì)棗幼胚發(fā)育的影響

結(jié)果表明，黑暗條件下幼胚發(fā)育率達(dá)51.76%;而在光照條件下，幼胚發(fā)育率為43.89%，其中部分幼胚出現(xiàn)子葉反卷現(xiàn)象。認(rèn)為暗培養(yǎng)利于幼胚正常發(fā)育，光照條件可誘發(fā)幼胚出現(xiàn)早熟萌發(fā)，產(chǎn)生畸形苗現(xiàn)象，使幼胚不能沿胚性正常發(fā)育。這一研究結(jié)果在張曼[13]對(duì)棗早期幼胚挽救影響因素研究中得到了證實(shí)。

2.5?低溫對(duì)幼胚發(fā)育的影響

由表4可知，接種前幼果進(jìn)行低溫處理對(duì)減緩畸形苗發(fā)生的影響較小。經(jīng)不同天數(shù)冷處理后，幼胚發(fā)育率分別為41.17%（0 d）、42.54%（20 d）、37.53%（40 d）、32.56%（60 d），經(jīng)冷處理40 d、60 d時(shí)，幼果品質(zhì)變劣，幼胚接種后出現(xiàn)內(nèi)生菌加重現(xiàn)象，污染率提高，很大程度上影響幼胚萌發(fā)率。而崔秀梅等[14]研究認(rèn)為，棗未成熟且胚齡為60 d以上的胚經(jīng)0～4 ℃冷藏60 d，可顯著提高胚的萌發(fā)率和成苗率。這與本研究結(jié)果不同，這可能與所選用幼胚的胚齡不同有關(guān)。

3?結(jié)論

適宜的培養(yǎng)條件能有效減少畸形苗的發(fā)生，促進(jìn)胚正常發(fā)育。在IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素條件下，可獲得較高的成胚率56.82%;合點(diǎn)端插入培養(yǎng)基的豎放方式可顯著促進(jìn)幼胚生長(zhǎng)發(fā)育，幼胚萌發(fā)率可達(dá)77.39%;胚乳看護(hù)時(shí)間45 d較為適宜;暗培養(yǎng)利于幼胚正常發(fā)育;接種前幼果進(jìn)行低溫處理對(duì)減緩畸形苗發(fā)生的影響較小。

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