GC-ECD法測(cè)定茵梔黃口服液（注射液）中23種有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留

王娟，李媛，王云霞，謝志民（西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054）

茵梔黃口服液（注射液）是2019年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽檢品種。茵梔黃注射液為原上海和黃藥業(yè)有限公司根據(jù)中醫(yī)名方“茵陳蒿湯”研制而成，茵梔黃口服液為原北京第四制藥廠由茵梔黃注射液改變劑型而來(lái)。目前，茵梔黃注射液全國(guó)有6 家生產(chǎn)企業(yè)擁有10 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，目前只有神威藥業(yè)有限公司少量生產(chǎn)；茵梔黃口服液全國(guó)只有北京華潤(rùn)高科天然藥物有限公司擁有1 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)（國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020607）。處方由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩提取物、金銀花提取物組成，具有清熱解毒、利濕退黃的功效。臨床上茵梔黃口服液用于治療新生兒黃疸[1-2]、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥[3]、肝硬化黃疸[4]、青少年膽心綜合征[5]等。茵梔黃注射液屢次報(bào)告不良反應(yīng)和事件[6-7]，國(guó)家藥品監(jiān)管總局在2016年8月23日發(fā)布了“總局關(guān)于修訂茵梔黃注射液說(shuō)明書(shū)的公告（2016年第140 號(hào)）”，公告附件中說(shuō)明書(shū)【禁忌】項(xiàng)包括“2.新生兒、嬰幼兒禁用；3.孕婦禁用”。

近年來(lái)，農(nóng)藥在中藥材種植中廣泛使用，中成藥的農(nóng)藥殘留問(wèn)題已引起關(guān)注，本品口服液經(jīng)常用于新生兒黃疸的治療，監(jiān)測(cè)農(nóng)藥殘留量尤為重要。有機(jī)氯農(nóng)藥如使用最早、應(yīng)用最廣的殺蟲(chóng)劑二二三（DDT）和六六六（BHC），BHC 雖已禁用多年，但不易降解，土壤中殘留明顯[8]，DDT 仍在使用，菊酯類農(nóng)藥則廣泛使用。金銀花在種植過(guò)程中病蟲(chóng)害頻繁且嚴(yán)重，農(nóng)藥防治是主要手段，農(nóng)藥殘留污染比較嚴(yán)重，檢出率較高[9-11]，有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥均有檢出。梔子中有檢出有機(jī)氯[12]，黃芩中有檢出BHC 和DDT[13]，茵陳尚未見(jiàn)報(bào)道，原藥材中可能有農(nóng)藥殘留，所以有必要監(jiān)測(cè)制劑的農(nóng)藥殘留量。筆者用GC-ECD 法測(cè)定茵梔黃口服液（注射液）中23 種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留，以期為茵梔黃口服液（注射液）安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890A 型氣相色譜儀、63NI-ECD 電子捕獲檢測(cè)器、HP-5 毛細(xì)管柱：（5%苯基）甲基聚硅氧烷柱（柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚度0.25 μm）（美國(guó)安捷倫公司）；RE 52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

17 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液（批號(hào)：610005-201802，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含六氯苯2.03 mg·L－1、α-六六六 1.98 mg·L－1、五氯硝基苯2.02 mg·L－1、γ-六六六 2.08 mg·L－1、七 氯1.97 mg·L－1、艾氏劑1.93 mg·L－1、β-六六六 1.49 mg·L－1、氧化氯丹2.09 mg·L－1、δ-六六六 1.99 mg·L－1、順式環(huán)氧七氯2.06 mg·L－1、反式環(huán)氧七氯1.95 mg·L－1、反式氯丹2.01 mg·L－1、順式氯丹2.04 mg·L－1、p，p'-滴滴伊2.04 mg·L－1、o，p'-滴滴涕2.06 mg·L－1、p，p'-滴滴滴2.05 mg·L－1、p，p'-滴滴涕20.8 mg·L－1）；對(duì)照品溶液百菌清[批號(hào)：GBW（E）081500-M351]、三唑酮[批號(hào)：GBW（E）081507-5252]、聯(lián)苯菊酯[批號(hào)：GBW（E）081474-53Μ1]、氯氰菊酯[批號(hào)：GBW（E）0811476-2BV2]、氰戊菊酯[批號(hào)：GBW（E）081471-J392]、溴氰菊酯[批號(hào)：GBW（E）081468-M351]（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司，濃度均為100 mg·L－1）；氯氟氰菊酯對(duì)照品（批號(hào)：SB05-42292018，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，濃度為100 mg·L－1）。

正己烷、丙酮均為農(nóng)殘級(jí)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉均為分析純。

1.3 樣品

樣品均為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽檢樣品，38 批次樣品來(lái)自于16 個(gè)省級(jí)行政區(qū)域，來(lái)自于藥品經(jīng)營(yíng)單位的有25 批次，來(lái)自于藥品使用單位的有13 批次，其中注射液6批（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、口服液32批（北京華潤(rùn)高科天然藥物有限公司）（批號(hào)分別為272388、272508、272538、272588、272608、272668、272678、272728、272738、272748、272788、272848、272858、272898、2721247、2721277、2721437、181001、181102、181107、181108、181110、181112、181113、181116、181209、181216、181217，其中口服液中有4 批批號(hào)重復(fù)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密量取百菌清對(duì)照品溶液、三唑酮對(duì)照品溶液、聯(lián)苯菊酯對(duì)照品溶液、氯氟氰菊酯對(duì)照品溶液、氯氰菊酯對(duì)照品溶液、氰戊菊酯對(duì)照品溶液、溴氰菊酯對(duì)照品溶液各0.2 mL，置同一50 mL 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為菊酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取17 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對(duì)照品液2 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入上述菊酯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取3 mL，置5 mL 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取茵梔黃口服液5 mL（注射液10 mL），加入丙酮-水（7∶3）的混合溶液15 mL（注射液30 mL），加入5%氯化鈉溶液10 mL（注射液20 mL），振搖 1 min，置分液漏斗中，用正己烷振搖提取3 次，每次10 mL （注射液20 mL），合并提取液，置裝有10 g 無(wú)水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，振搖，放置30 min。濾過(guò)，用少量正己烷洗滌殘?jiān)盀V紙，與上述濾液合并，于40℃減壓濃縮至近干，用正己烷2 mL 分3 次溶解并轉(zhuǎn)移至佛羅里硅土固相萃取小柱[（博納艾杰爾），用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 和正己烷10 mL 預(yù)洗]上，用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 洗脫，收集上樣液和洗脫液，40℃減壓濃縮至干，加少量正己烷反復(fù)3 次操作至丙酮除盡，加正己烷使溶解，定量轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3 色譜條件

采用（5%苯基）甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱，63NIECD 電子捕獲檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度330℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫：初始60℃，保持1 min；以90℃·min－1速率升至150℃，保持5 min；以1℃·min－1速率升至160℃，保持10 min；以2℃·min－1速率升至220℃；以10℃·min－1速率升至280℃，保持6 min；以10℃·min－1速率升至290℃，保持10 min。載氣高純氮，99.999%，流速60 mL·min－1，進(jìn)樣量1 μL。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取陰性茵梔黃口服液（批號(hào)：181206，經(jīng)檢測(cè)未含有機(jī)氯和農(nóng)藥殘留的樣品），按照“2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 2 mL，置具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈?，精密加入茵梔黃口服液 （批號(hào)：181206）5 mL。按照“2.2”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)供試品溶液。分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及上述陰性樣品溶液及加標(biāo)供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。在該色譜條件下，各色譜峰分離良好，峰形對(duì)稱，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 茵梔黃口服液（注射液）氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatogram of Yinzhihuang oral liquid （injection）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密量取17 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液2 mL，置5 mL 量瓶中，精密加入“2.1”項(xiàng)下菊酯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋制成不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取系列混合對(duì)照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以對(duì)照品溶液（μg·L－1）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程，相關(guān)系數(shù)均＞0.999。說(shuō)明在該系統(tǒng)條件下，各組分在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.2 儀器精密度考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各1 μL，每份進(jìn)樣6 次，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果除o，p'-滴滴涕RSD為2.1%、氯氰菊酯RSD為2.5%外，其余21種農(nóng)藥的RSD均小于2.0%。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL 共6 份，置具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈?，精密加入茵梔黃口服液（批號(hào)：181206）5 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和樣品溶液各1 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定（n＝3）。按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量RSD，結(jié)果均小于1.2%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、8、12、16、20 和24 h 精密吸取重復(fù)性考察項(xiàng)同一供試品溶液1 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果23 種農(nóng)藥峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液中23 種農(nóng)藥在24 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液6份，分別加入含百菌清、三唑酮和5 種菊酯濃度32 μg·L－1、其余17 種有機(jī)氯濃度160 μg·L－1的混合對(duì)照品溶液3 mL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果23 種農(nóng)藥的回收率為81.68%～116.2%（見(jiàn)表2）。

2.5.6 檢測(cè)限和定量限

① 加樣對(duì)照品溶液的制備：精密量取各對(duì)照品溶液制成含百菌清、三唑酮、5 種菊酯質(zhì)量濃度為6 μg·L－1，17 種有機(jī)氯質(zhì)量濃度為20 μg·L－1的溶液作為1 號(hào)混合對(duì)照品溶液；稀釋制成百菌清、三唑酮、5 種菊酯質(zhì)量濃度1.8 μg·L－1、17 種有機(jī)氯質(zhì)量濃度6 μg·L－1的溶液作為2 號(hào)混合對(duì)照品溶液。

② 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定：精密量取上述1號(hào)混合對(duì)照品溶液0.7 mL、1.3 mL，2 號(hào)混合對(duì)照品溶液0.7 mL、1.3 mL，置具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈?，分別精密加入茵梔黃口服液（批號(hào)：181110）樣品5 mL，共4 份，按照“2.2”項(xiàng)下樣品制備方法，制備供試品溶液。按“2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定，以基線噪音3 倍量峰高時(shí)的含量為檢測(cè)限、10 倍量峰高時(shí)的含量為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類的回歸方程Tab 1 Regression equation of organochlorine and pyrethroid pesticides

表2 有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類的添加回收試驗(yàn)、檢測(cè)限及定量限Tab 2 Recovery，limit of detection and limit of quantitative of organochlorine and pyrethroid pesticides

2.6 樣品的含量測(cè)定

對(duì)28 批口服液、6 批注射液進(jìn)行測(cè)定，均未檢出農(nóng)藥殘留。結(jié)果均符合按新生兒（體質(zhì)量5 kg）一日最大服用量計(jì)算的限度。

3 討論

3.1 11 號(hào)色譜峰的說(shuō)明

色譜圖中11 號(hào)峰為環(huán)氧七氯，是順式環(huán)氧七氯和反式環(huán)氧七氯的混合物。

3.2 樣品提取、凈化方法的選擇

筆者比較了濃硫酸凈化和固相萃取柱（Florisil）凈化兩種方法，結(jié)果菊酯類農(nóng)藥在濃硫酸凈化中幾乎零回收，故選用固相萃取柱凈化法[14-16]。茵梔黃口服液制法中每1000 mL 含有蔗糖100 g、蜂蜜50 g[17]，屬于高糖樣品，在提取過(guò)程中應(yīng)去除糖類物質(zhì)的干擾。丙酮水溶液的鹽析作用可除去糖類等水溶性的雜質(zhì)，用于含多糖類樣品中農(nóng)藥的提取。