胰島素抵抗HepG2細胞模型建立的正交實驗研究

王金鳳，王芳，王國玉，楊翠燕，趙慶蘭（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六四醫(yī)院，長春 130062）

胰島素抵抗（IR）是2 型糖尿病、高脂血癥、高血壓病、冠心病和脂肪肝等一系列代謝相關疾病發(fā)生、發(fā)展的原動力，是其共同的病理生理基礎[1]。肝臟是胰島素（INS）的主要效應器官，是攝取、儲存、合成和代謝葡萄糖的主要場所，在維持血糖穩(wěn)定中起著最直接和最重要的作用[2]。因此，肝細胞糖代謝紊亂對IR 的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

HepG2 細胞源于人的肝胚胎瘤細胞，具有類似肝細胞代謝功能，是體外研究IR 發(fā)病機制和降糖藥物篩選及作用機制最常用的細胞模型[3]。人體IR 最主要的誘發(fā)因素是過量的糖和脂肪及繼發(fā)性高胰島素血癥[4-5]，體外細胞學實驗亦證明棕櫚酸（PA）、INS、高糖可誘導HepG2 細胞建立IR模型[6-7]。然而，研究發(fā)現INS 誘導模型穩(wěn)定性差，PA 對細胞損傷性大，單純高糖的作用小，并非理想的IR 細胞模型[8]。本文采用高糖培養(yǎng)基，正交實驗優(yōu)選PA、INS 聯合應用建立HepG2 細胞IR 模型的最佳條件，為IR 防治藥物篩選及其發(fā)病機制研究提供良好的細胞模型。

1 材料

1.1 細胞系

人肝癌 HepG2 細胞（中科院上海細胞庫）。

1.2 試藥

胰島素注射液（400 U/10 mL，萬邦生化醫(yī)藥集團）；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma 公司）；高糖培養(yǎng)基（DMEM，批號：1993859，Gibco 公司）；優(yōu)級胎牛血清（FBS，貨號：TBD21HY，灝洋生物制品科技有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（貨號：A031，長春匯力生物技術有限公司）；糖原檢測試劑盒（貨號：A043，南京建成生物研究所）。

1.3 儀器

UV-3200S 紫外分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司）；MK3 酶標儀（Thermo Labsystems 公司）；HF90 CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司）；CK40 倒置顯微鏡（OLYMPUS 公司）。

2 方法

2.1 HepG2 細胞培養(yǎng)

HepG2 細胞復蘇后，用含15% FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁長滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次。加適量0.25%胰蛋白酶消化，按1︰3 的比例傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 INS、PA 對細胞增殖的影響

根據參考文獻[9-10]和預實驗結果，將細胞以每孔1×104個接種于96 孔培養(yǎng)板，分為對照組和模型組，每組6 孔。待細胞單層貼壁生長至50%左右，對照組加正常培養(yǎng)液，模型組加新配制的不同濃度的INS 和PA 培養(yǎng)液200 μL（均含10%FBS）。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，分別于24、36、48、60 h 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)后，每孔加5 mg·mL－1MTT 10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 100 μL，充分混勻溶解結晶后，于酶標儀492、630 nm 雙波長處測量吸光度值（A492）。

2.3 正交實驗優(yōu)選HepG2 細胞IR 模型培養(yǎng)條件

以INS（A）、PA（B）及孵育時間（C）作為影響因素，選擇對細胞損傷較小、濃度較大的3個水平，見表1。按照L9（34）正交表進行實驗。

表1 因素水平表Tab 1 Factor and level

將細胞以每孔5×104個接種于3個24孔培養(yǎng)板。每板設1 個對照組和3 個孵育時間相同的模型組，每組6 孔。待細胞單層貼壁生長至50%左右時，對照組加正常培養(yǎng)液，模型組按正交實驗表加新配制不同濃度的INS、PA 條件培養(yǎng)液（均含10%FBS）。37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)（36 h 和48 h 組次日換相同條件培養(yǎng)液1 次）。培養(yǎng)至預定時間，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍，換含5%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液500 μL。培養(yǎng)24 h 后，應用葡萄糖測定試劑盒檢測上清液葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量（GC）[11]。每孔加5 mg·mL－1MTT 40 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加DMSO 400 μL。充分混勻溶解結晶后，于酶標儀492、630 nm 雙波長處測量其吸光度值（A492）。GC/A492為校正葡萄糖消耗量，以消除細胞數量對葡萄糖消耗的影響。

計算模型組與對照組的GC/A492差值（ΔGC/A492），差值最大的即為最佳條件，重復實驗3 次。以ΔGC/A492為評價指標，對正交實驗結果進行方差分析和顯著性檢驗，確定HepG2 細胞IR 模型建立的最佳條件。

2.4 HepG2 細胞IR 模型持續(xù)時間的研究

采用最佳方法造模后，將對照組與模型組細胞同時置于5% FBS 高糖培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48、60 h，每日換液一次，測定各組細胞在不同時間的GC/A492。

2.5 糖原檢測

參考文獻[12]并加以改進檢測糖原。細胞接種至6 孔培養(yǎng)板，建立IR 細胞模型后，吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍。加入胰酶消化后，小心吸棄胰酶，每孔加1 mL PBS 吹打混勻。取200 μL 離心后去上清液，加入50 μL 細胞裂解液，雙蒸水定容至2 mL，紫外吸收法測定蛋白濃度[13]。余液取700 μL 加入堿提取液，蒽酮法測定糖原[14]，重復實驗3 次。計算每克蛋白中的糖原含量。

2.6 HepG2 細胞IR 模型油紅O 染色

稱取油紅O 粉末0.5 g 溶于異丙醇100 mL，制成油紅O 儲備液。使用時將油紅O 儲備液與雙蒸水按3∶2（V/V）混合，0.45 μm 濾膜過濾制得澄清工作液。細胞接種至6 孔培養(yǎng)板，建立IR細胞模型后，吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 遍；4%多聚甲醛固定15 min，棄多聚甲醛；PBS 再洗滌3 遍，每次5 min；每孔加油紅O 工作液500 μL，于室溫下染色15 min；棄去油紅O 染液，PBS 洗滌3 遍，每次5 min。鏡下觀察各組細胞形態(tài)。

2.7 統計學方法

實驗數據用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 24.0 統計軟件進行數據分析。兩組間計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 INS 對細胞增殖的影響

INS 在0.05 ～0.5 μmol·L－1內孵育HepG2細胞60 h，其吸光度值顯著高于對照組，表明INS 有促進細胞增殖作用。并且隨著INS 濃度的增加和作用時間的延長作用增強；在1.0 ～5.0 μmol·L－1培養(yǎng)48 h，隨著INS 濃度的增加促增殖作用強度減??；48 h 內隨著作用時間的延長吸光度值增加。但作用60 h 時，吸光度值明顯下降，2.0 ～5.0 μmol·L－1組顯著低于對照組，呈現抑制作用。表明高濃度INS 長時間作用具有抑制細胞增殖作用。當INS 為10.0 μmol·L－1時，孵育24 h 吸光度值低于對照組，36 h 后差異顯著，表現為細胞損傷作用。其中INS 1.0 μmol·L－1作用48 h 的促增殖作用最強。見表2。

表2 INS 濃度、孵育時間對細胞增殖活性的影響(± s，n ＝6)Tab 2 Effect of INS concentration and time on the cell proliferation (± s，n ＝6)

表2 INS 濃度、孵育時間對細胞增殖活性的影響(± s，n ＝6)Tab 2 Effect of INS concentration and time on the cell proliferation (± s，n ＝6)

注（Note）：與對照組比較，**P ＜0.01（Compared with the control group，**P ＜0.01）。

INS/（μmol·L－1） 吸光度值24 h 36 h 48 h 60 h對照組 0.412±0.012 0.581±0.016 0.730±0.014 0.903±0.019 0.05 0.467±0.008** 0.652±0.012** 0.856±0.014** 1.023±0.024**0.1 0.491±0.010** 0.674±0.014** 0.886±0.017** 1.081±0.016**0.5 0.581±0.012** 0.704±0.018** 0.899±0.021** 1.116±0.019**1.0 0.623±0.009** 0.782±0.017** 0.986±0.008** 0.966±0.015**2.0 0.605±0.007** 0.719±0.019** 0.885±0.009** 0.779±0.014**5.0 0.449±0.015** 0.616±0.016** 0.778±0.016** 0.712±0.016**10.0 0.401±0.013 0.516±0.010** 0.451±0.008** 0.361±0.007**

3.2 PA 對細胞增殖的影響

PA 濃度為10 ～40 μmol·L－1時，作用于HepG2 細胞24 h，其吸光度值與對照組相近，對細胞增殖無明顯影響。濃度為30、40 μmol·L－1PA 孵育36 h 開始出現顯著抑制作用，且隨作用時間的延長抑制作用增強。PA 20 μmol·L－1孵育48 h 出現明顯抑制作用，PA 為10 μmol·L－1時培養(yǎng)60 h 無明顯影響。PA 在60 ～400 μmol·L－1孵育24 h 即有細胞損傷作用，而且隨著濃度的增加和時間的延長損傷作用增強。鏡下觀察受損細胞狀態(tài)差，表現為細胞體積縮小，由大的多邊形變?yōu)樾〉募氶L條形，折光性差，連接消失，并可見大量脫落細胞（見表3）。

表3 PA 濃度、孵育時間對細胞增殖活性的影響(± s，n ＝6)Tab 3 Effects of PA concentration and time on the cell proliferation (± s，n ＝6)

表3 PA 濃度、孵育時間對細胞增殖活性的影響(± s，n ＝6)Tab 3 Effects of PA concentration and time on the cell proliferation (± s，n ＝6)

注（Note）：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

PA/（μmol·L－1） 吸光度值images/BZ_75_1597_2361_1949_2376.png24 h 36 h 48 h 60 h對照組 0.523±0.012 0.549±0.016 0.584±0.014 0.627±0.019 10 0.537±0.012 0.559±0.012 0.590±0.017 0.632±0.014 20 0.540±0.011 0.552±0.012 0.554±0.016* 0.494±0.011**30 0.517±0.012 0.511±0.010** 0.488±0.018** 0.373±0.011**40 0.515±0.010 0.487±0.013** 0.424±0.014** 0.345±0.016**60 0.497±0.018 0.433±0.012** 0.350±0.016** 0.308±0.016**80 0.466±0.012** 0.370±0.008** 0.303±0.014** 0.233±0.008**100 0.428±0.016** 0.277±0.012** 0.170±0.007** 0.143±0.005**200 0.346±0.009** 0.179±0.006** 0.116±0.007** 0.109±0.005**400 0.286±0.003** 0.122±0.009** 0.097±0.009** 0.071±0.004**

3.3 正交實驗結果

由極差（R）得出，影響葡萄糖消耗的主次因素順序為 C ＞B ＞A，即孵育時間＞PA ＞INS，其中20 μmol·L－1PA 和2.0 μmol·L－1INS 作用最強，孵育最佳時間是 48 h，見表4。聯合應用PA 和INS，顯示A2B1C2、A2B2C3和A3B1C3作為誘導條件葡萄糖消耗減少明顯，均超過20%。把空白作為誤差列進行方差分析，見表5。經方差分析和顯著性檢驗結果表明，孵育時間、PA 及INS 對葡萄糖消耗均有顯著性影響（P＜0.05）。

表4 正交實驗結果分析Tab 4 Analysis of orthogonal experiment

3.4 驗證實驗結果

依據正交實驗結果進一步比較A2B1C3、A2B2C3、A3B1C3和A3B2C3，結果見表6。A2B1C3葡萄糖消耗最低，A3B2C3最高，且兩組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。A2B1C3雖然與A2B2C3、A3B1C3相近，但差異無統計學意義。考慮低濃度、小劑量、長時間作用，更接近人體IR 形成的病理生理過程，故選用A2B1C3作為聯合誘導的造模條件（稱為聯合誘導組）。3 次驗證性實驗結果顯示，聯合誘導組較對照組葡萄糖消耗明顯減少，ΔGC/A492分別為20.45%、22.43%和21.19%。表明重復性好，穩(wěn)定可靠。

表5 方差分析Tab 5 Analysis of variance

3.5 HepG2 細胞IR 模型的穩(wěn)定時間

各模型組細胞的葡萄糖消耗量在48 h 內均顯著低于對照組細胞（P＜0.01），其中以24 h 葡萄糖消耗減少幅度最大，見表7、圖1。表明本方法建立的IR HepG2細胞模型24 h 最佳，48 h 內穩(wěn)定。

表6 作用相近聯合誘導條件下葡萄糖消耗量的比較(± s，n ＝6，%)Tab 6 Glucose consumption under combined induction conditions with similar effects (± s，n ＝6，%)

表6 作用相近聯合誘導條件下葡萄糖消耗量的比較(± s，n ＝6，%)Tab 6 Glucose consumption under combined induction conditions with similar effects (± s，n ＝6，%)

注（Note）：與對照組比較，*P ＜0.05；與A2B1C3 比較，ΔP ＜0.05（Compared with the control group，*P ＜0.05；compared with the A2B1C3 group，ΔP ＜0.05）。

組別 GC/A492第1 次 第2 次 第3 次 x對照組 6.112±0.279 5.996±0.558 5.872±0.248 5.993±0.120 A2B1C3 4.736±0.129** 4.670±0.229** 4.341±0.232** 4.582±0.212**A2B2C3 4.967±0.189** 4.774±0.614* 4.445±0.276** 4.729±0.264**A3B1C3 5.012±0.193** 4.461±0.210** 4.401±0.197** 4.625±0.337**A3B2C3 5.133±0.222** 4.864±0.082** 5.012±0.386**Δ 5.003±0.135**Δ

表7 IR 細胞模型不同時間葡萄糖消耗量的變化(± s，n ＝6，%)Tab 7 Effect of different time on glucose consumption in IR cell model (± s，n ＝6，%)

表7 IR 細胞模型不同時間葡萄糖消耗量的變化(± s，n ＝6，%)Tab 7 Effect of different time on glucose consumption in IR cell model (± s，n ＝6，%)

注（Note）：與對照組比較，**P ＜0.01（compared with the control group，**P ＜0.01）。

組別 GC/A492 24 h 36 h 48 h 60 h對照組 6.259±0.229 5.644±0.164 5.622±0.210 5.446±0.329聯合誘導組 4.764±0.618** 4.495±0.397** 4.555±0.394** 4.780±0.377

3.6 IR 模型細胞糖原含量的變化

IR 模型建立后，蒽酮法檢測HepG2 細胞糖原含量，并用蛋白質濃度進行校準，結果IR 細胞糖原含量顯著低于對照組[（63.72±7.29）mg·g－1vs（83.50±5.17）mg·g－1，P＜0.01），降低百分比為23.69%。

3.7 IR 模型細胞的形態(tài)變化

造模后油紅O 染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，脂肪滴被染成鮮紅色。與對照組比較，模型組細胞體積增大，細胞中鮮紅色脂滴顯著增多，見圖2。

圖1 IR 細胞模型不同時間平均葡萄糖消耗減少的百分比（ΔGC/A492，%）Fig 1 Percentage reduction of average glucose consumption at different time in IR cell model（ΔGC/A492，%）

圖2 正常HepG2 細胞（A）與IR 細胞（B）的形態(tài)比較（×200）Fig 2 Lipid droplet morphology between normal HepG2（A）and IR cells（B）（×200）

4 討論

4.1 正交實驗條件的選擇

INS 是具有促進糖原、蛋白、脂肪合成及細胞分裂增殖作用的蛋白質激素[15]。本研究發(fā)現1.0 μmol·L－1的INS 孵育HepG2 細胞48 h 促細胞增殖作用最強，小于此濃度其促增殖作用呈劑量依賴性增強，高于此濃度促增殖作用強度進行性減弱，甚至出現抑制現象。因此選擇INS 濃度為 0.5、1.0、2.0 μmol·L－1作為正交實驗條件。PA 細胞毒性增大，多次反復實驗均表明，只有10 μmol·L－1的PA，作用時間在60 h 內，對細胞增殖活性無明顯影響。PA 濃度20 μmol·L－1作用48 h 和30 μmol·L－1作用36 h 開始出現抑制現象，隨著PA 濃度進一步增加和作用時間延長，細胞損傷作用增強。因此，選擇10、20、30 μmol·L－1濃度為PA 的3 個水平，孵育時間設定為24、36 和48 h。

4.2 IR 細胞模型最佳條件的確定

研究選用L9（34）正交表進行實驗，驗證實驗結果顯示，INS 1.0 μmol·L－1、PA 10 μmol·L－1，孵育48 h（A2B1C3）更接近人體IR 形成的病理生理過程，葡萄糖消耗減少達22.36%，并且3 次驗證實驗結果表明重復性好，穩(wěn)定可靠。而聯合應用作用最強的INS 2.0 μmol·L－1和PA 20 μmol·L－1分別培養(yǎng)24 h 和48 h，檢測葡萄糖消耗量；結果24 h 葡萄糖消耗減少不明顯，而48 h 因細胞死亡明顯增加，導致葡萄糖消耗（ΔGC/A492）增加。同時考察了20 μmol·L－1PA 聯合1.0 μmol·L－1INS 和10 μmol·L－1PA 聯合2.0 μmol·L－1INS，但葡萄糖消耗減少程度并不優(yōu)于A2B1C3組。故高糖培養(yǎng)基加10 μmol·L－1PA 聯合1.0 μmol·L－1INS孵育48 h為建立HepG2 細胞IR 模型的最佳條件。

穩(wěn)定性實驗表明，細胞模型IR 作用可持續(xù)存在48 h，24 h 作用最強，結果穩(wěn)定。糖原檢測結果顯示，模型組糖原合成顯著減少，油紅O 染色見模型組細胞脂肪顆粒顯著增加，進一步證明此方法建立的IR 細胞模型準確可靠。

4.3 成功建模的關鍵因素

4.3.1 適宜的細胞密度 研究發(fā)現HepG2 細胞呈抱團式生長，細胞稀少時生長緩慢，對條件培養(yǎng)基的耐受性差。細胞過多，因接觸性抑制，細胞活力下降，處于低代謝狀態(tài)[16]。雖然密集的細胞耐受性增強，但對條件培養(yǎng)基的敏感性下降。而且，由于細胞代謝活力下降，葡萄糖消耗減少。因此，細胞密度是葡萄糖消耗的重要影響因素。細胞貼壁50%左右時加條件培養(yǎng)基較為適宜，并可根據培養(yǎng)時間和條件的不同適當調整。

4.3.2 葡萄糖的精準測定 培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量是判斷模型成敗的決定性指標。葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖是通過紫外分光光度儀檢測其吸光度值而實現。因線性范圍限制，高糖培養(yǎng)基只能取15 μL 左右。取樣量越小，隨機誤差越大，導致樣本平行性差，影響結果評價。本研究采用24 孔培養(yǎng)板，精密吸取100 μL 上清液，10 倍稀釋后，再取150 μL 進行測定，平行檢測3 次?？商岣邫z測準確性，使結果更加客觀準確。

綜上所述，采用較小劑量INS、PA 聯合高糖培養(yǎng)基，較長孵育時間建立HepG2 細胞IR 模型。不僅對細胞損傷小，而且接近人體IR 的病理生理過程，為防治IR 藥物篩選及發(fā)病機制研究奠定基礎。