普樂(lè)沙福的波譜學(xué)特征和結(jié)構(gòu)確證

江任之，梁平，王玲，程紅，曾甜甜，嚴(yán)定策（華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心，武漢 430074）

普樂(lè)沙福（plerixafor）是一種趨化因子受體4（CXCR4）特異性拮抗劑。由美國(guó)健贊公司（Genzyme Corporation）研發(fā)，2008年12月 經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，商品名稱為Mozobil。2010年7月，通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，在國(guó)內(nèi)上市[1-4]。該藥物能阻斷CXCR4 與其同源配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）的結(jié)合和相互作用，并阻止造血干細(xì)胞進(jìn)入骨髓。普樂(lè)沙福屬于造血干細(xì)胞動(dòng)員藥，調(diào)動(dòng)干細(xì)胞從骨髓進(jìn)入血液循環(huán)，用于多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤等成年腫瘤患者的自體干細(xì)胞移植[5-6]。普樂(lè)沙福是一種白色或類白色粉末，其化學(xué)名稱為1，1'-[1，4-亞苯基（亞甲基）]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷，分子式：C28H54N8，相對(duì)分子質(zhì)量：502.78，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。由于屬于罕用藥物，普樂(lè)沙福的相關(guān)研究主要集中在合成工藝改進(jìn)[2，4，7-10]、合成中有關(guān)物質(zhì)液相色譜分析方法建立[11]、藥物的藥理作用和臨床評(píng)價(jià)[5-6，12-13]等領(lǐng)域。目前，其全面完整的波譜學(xué)特征尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用紫外吸收光譜（UV）、紅外吸收光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等分析測(cè)試技術(shù)，依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版的規(guī)定要求，對(duì)普樂(lè)沙福樣品進(jìn)行全面完整的波譜學(xué)表征和結(jié)構(gòu)確證[14]，為普樂(lè)沙福的質(zhì)量控制提供較全面的參考依據(jù)，也為各種波譜學(xué)方法在結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用提供實(shí)例[15-16]。

圖1 普樂(lè)沙福的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of plerixafor

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Lambda35 型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer 公司）；Vertex 70 型傅立葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker 公司）；AscendTM600M 超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；LC/MS TRAPXCT 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；Pyris1 TGA 熱重分析儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；DSC差示掃描量熱儀（Diamond）；Empyrean X 射線衍射儀（荷蘭PANalytical B.V.公司）。

1.2 試藥

普樂(lè)沙福（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：M02028，HPLC 分析純度＞99%，符合藥物結(jié)構(gòu)鑒定的需要）；氘代甲醇（MeOD，美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜（UV）

將適量樣品分別溶于水、0.1 mol·L－1HCl溶液、0.1 mol·L－1NaOH 溶液中，適當(dāng)稀釋，測(cè)定其紫外吸收光譜，如圖2所示。當(dāng)溶于水中時(shí)（見圖2A），樣品在220、260 nm 附近有吸收峰；當(dāng)溶于0.1 mol·L－1HCl 溶液中時(shí)（見圖2B），樣品于218、266、272 nm 附近有吸收峰；當(dāng)溶于0.1 mol·L－1NaOH 溶液中時(shí)（見圖2C），樣品在219、263 nm 附近有吸收峰。說(shuō)明樣品含有共軛結(jié)構(gòu)，與普樂(lè)沙?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)吻合。

圖2 普樂(lè)沙福溶于水（A），0.1 mol·L－1 HCl 溶液（B）及0.1 mol·L－1 NaOH 溶液中的紫外吸收光譜（C）Fig 2 UV spectra of plerixafor solved in water（A），0.1 mol·L－ 1 HCl solution（B），and 0.1 mol·L－1 NaOH solution（C）

2.2 紅外光譜（IR）

以溴化鉀為參比，壓片法得到普樂(lè)沙福樣片的紅外光譜圖見圖3。根據(jù)譜圖所得紅外吸收峰數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，具體情況見表1。結(jié)果表明，普樂(lè)沙福含有大環(huán)烷、亞甲基、脂肪族仲胺、脂肪族叔胺、1，4-二取代苯環(huán)等結(jié)構(gòu)。

2.3 核磁共振譜（NMR）

圖3 普樂(lè)沙福的紅外光譜圖Fig 3 IR spectrum of plerixafor

表1 普樂(lè)沙福紅外光譜數(shù)據(jù)與解析Tab 1 IR data and analysis of plerixafor

普樂(lè)沙福樣品的1H-NMR 圖譜見圖4，DEPT 135圖譜見圖5，1H-1H COSY 圖譜見圖6，13C-1H HMBC圖譜見圖7，13C-1H HSQC 圖譜見圖8，13C-NMR 圖譜見圖9。其中δH3.30 ppm 和δC47.70 ppm 為MeOD中的溶劑峰；δH4.80 ppm 為溶劑中水峰信號(hào)。因溶劑中含有少量水，故未觀察到活潑H 的信號(hào)。

2.3.11H 核磁共振譜（1H-NMR） H 譜中，由于環(huán)空間構(gòu)型的影響，環(huán)上的CH2上的2 個(gè)H 不等價(jià)，造成高場(chǎng)區(qū)H 譜譜峰重疊嚴(yán)重。

由δH7.321 ppm 化學(xué)位移在低場(chǎng)，分析為對(duì)苯取代上CH，由HMBC 可知，δH7.321 ppm 與δC137.15 ppm 和δC57.15 ppm 相關(guān)，則δC137.15 ppm為C1，C4；δC57.15 ppm 為C11'，結(jié) 合HSQC 可知，δH3.583 ppm 為H11'，在HMBC 中，H11'和H11''與δC54.08 ppm 相關(guān)，故δC54.08 ppm 為C1'，則δH2.625 ～2.608 ppm 中有H1'。

2.3.213C 核磁共振譜（13C-NMR） 從C 譜、DEPT 135 和DEPT 90 可知，樣品中含有11 種仲碳、1 種叔碳、1 種季碳，結(jié)合樣品的對(duì)稱性可知，樣品中有22 個(gè)仲碳、4 個(gè)叔碳、2 個(gè)季碳。

從化學(xué)位移可知，δC137.15 ppm 低場(chǎng)，為對(duì)苯取代是季碳，δC129.09 ppm 則為對(duì)苯取代上的叔碳?；瘜W(xué)位移在δC40 ～60 ppm 的則為與N 雜原子相鄰的CH2，化學(xué)位移在20 ～30 ppm 的多為C 鏈上的CH2。

由HSQC 可知，δC25.29 ppm 對(duì)應(yīng)的是δH1.873ppm；δC27.93 ppm 對(duì)應(yīng)的是δH1.651 ppm；在HMBC中，δH1.873 ppm 分別與δC50.55 ppm 和δC49.56 ppm相關(guān)，δH1.651 ppm分別與δC49.16 ppm 和δC53.91 ppm 相關(guān)，由此可知存在片段：N-δC50.55-δC25.29-δC49.56-N 和N-δC49.16-δC27.93-δC53.91-N，即C3'-C4'-C5'和C8'-C9'-C10'。

表2 普樂(lè)沙福樣品的NMR 數(shù)據(jù)及解析Tab 2 NMR data and analysis of plerixafor

2.4 高分辨率質(zhì)譜（MS）

圖4 普樂(lè)沙福的1H-NMR 圖譜Fig 4 1H-NMR spectrum of plerixafor

圖5 普樂(lè)沙福的DEPT 135 圖譜Fig 5 DEPT 135 spectrum of plerixafor

圖6 普樂(lè)沙福的1H-1H COSY 圖譜Fig 6 1H-1H COSY spectrum of plerixafor

圖7 普樂(lè)沙福的13C-1H HMBC 圖譜Fig 7 13C-1H HMBC spectrum of plerixafor

圖8 普樂(lè)沙福的13C-1H HSQC 圖譜Fig 8 13C-1H HSQC spectrum of plerixafor

圖9 普樂(lè)沙福的13C-NMR 圖譜Fig 9 13C-NMR spectrum of plerixafor

取適量樣品，用甲醇溶解并經(jīng)0.22 μm 的兩相膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣，采用APCI 正模式，進(jìn)行質(zhì)譜分析。普樂(lè)沙福樣品的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖見圖10。在一級(jí)質(zhì)譜圖（圖10A）中可見準(zhǔn)分子[M＋H]＋（A）離子峰，分子量為503。經(jīng)軟件模擬，推測(cè)m/z503.2 的分子式為C28H54N8。

由m/z503.2 的二級(jí)質(zhì)譜推測(cè)，A 失去NH3得到碎片B，分子量為486；B 失去C2H2得到碎片C，分子量為460；C 失去CH2得到碎片D，分子量為446；D 失去NH3得到碎片E，分子量為429；E 失去C2H2得到碎片F(xiàn)，分子量為403；F再失去C2H2得到碎片G，分子量為377；G 失去NH3得到碎片H，分子量為360；H 失去CH2得到碎片I，分子量為346；I 失去CH2CHNH2得到碎片J，分子量為303；J 失去C8H9N 得到碎片K，分子量為184；K 失去CH2CHNH2得到碎片L，分子量為141。質(zhì)譜解析結(jié)果如圖11所示。

圖10 普樂(lè)沙福的一級(jí)質(zhì)譜圖（A）和二級(jí)質(zhì)譜圖（B）Fig 10 MS spectrum（A）and MS characteristic spectrum（B）of plerixafor

通過(guò)元素分析儀測(cè)試，樣品中C、H 和N元素的質(zhì)量百分比分別為66.79%、10.960%和22.26%，推測(cè)樣品中C∶H∶N 原子個(gè)數(shù)比為14∶27∶4。說(shuō)明質(zhì)譜結(jié)果與元素分析結(jié)果一致，由此可以確定所測(cè)樣品的分子式為C28H54N8，與普樂(lè)沙福的分子式相同。

2.5 熱分析與X-射線衍射

稱量適量樣品，用高純氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，氣流速度，從30℃升溫至800℃，升溫速度5℃·min－1，測(cè)得樣品的熱重分析（TGA）曲線。差熱分析（DSC）的測(cè)試條件為：在20 mL·min－1的氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以空鋁坩堝為參比，取樣品適量于鋁皿中稱重壓片后從100℃以5℃·min－1升溫到160℃。由樣品的TGA 圖（見圖12）可知，樣品在30 ～800℃總失重率為99.7%，樣品溫度升高到220℃后逐漸分解揮發(fā)；由DSC 圖可見一個(gè)向上的吸熱峰，熔融起始溫度131.2℃，頂點(diǎn)溫度133.9℃，終止溫度134.8℃，熔融熱焓164.5 J·g－1，推測(cè)為樣品熔融峰，與文獻(xiàn)報(bào)道的普樂(lè)沙福的熔點(diǎn)比較接近[2]（見圖13）。

圖11 普樂(lè)沙福的質(zhì)譜解析圖Fig 11 Analysis result of MS spectrum of plerixafor

表3 普樂(lè)沙福樣品X-射線粉末衍射數(shù)據(jù)Tab 3 X-ray powder diffraction data of plerixafor

圖12 普樂(lè)沙福的熱重分析圖Fig 12 TGA curve of plerixafor

圖13 普樂(lè)沙福的差熱分析圖Fig 13 DSC curve of plerixafor

取適量樣品于玻璃凹槽中壓平，在2θ＝3°～60°內(nèi)掃描得到X 射線衍射圖譜，衍射峰的相關(guān)數(shù)據(jù)見表3，可知樣品呈多晶態(tài)。

3 結(jié)論

通過(guò)UV、IR、MS 以及NMR 一維及二維譜測(cè)試技術(shù)，獲得了目標(biāo)化合物的波譜學(xué)數(shù)據(jù)，經(jīng)分析目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)與普樂(lè)沙福一致。并且通過(guò)元素分析、熱分析、X-射線粉末衍射等測(cè)試技術(shù)進(jìn)行佐證。測(cè)試方法符合《中國(guó)藥典》要求，各圖譜歸屬合理，數(shù)據(jù)保持高度的一致性，最終準(zhǔn)確確證普樂(lè)沙福的結(jié)構(gòu)。以上波譜學(xué)特征分析不僅能夠準(zhǔn)確說(shuō)明普樂(lè)沙福的結(jié)構(gòu)，也為該藥物定性研究和生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了分析和客觀的參考依據(jù)。