活絡(luò)通腦片對大鼠腦缺血再灌注損傷的治療作用

林艷霞，張勝杰，耿海局，王權(quán)，馬仁強(qiáng)，陳健文*（.深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司，廣東 深圳5888；.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 50006）

腦卒中俗稱中風(fēng)，是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn)。腦卒中死亡率已超過缺血性心臟病、肺癌、慢性阻塞性肺疾病和肝癌，僅次于惡性腫瘤，每年大約有2200 萬人發(fā)病[1]。腦卒中主要包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中和蛛網(wǎng)膜下腔出血，以缺血性腦卒中最為常見（占87%[2]），其中患者病后殘疾率高達(dá)25%[3]。目前，關(guān)于缺血性腦卒中的治療指南推薦的方法包括溶栓、腦神經(jīng)元保護(hù)、降低顱內(nèi)壓、抗凝、抗血小板聚集、降纖、腦血管支架植入、康復(fù)及心理治療、改善腦循環(huán)等，后續(xù)治療藥物卻相對有限。因此，研發(fā)療效確切的新藥十分必要。

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥源遠(yuǎn)流長，具有本身獨(dú)特的理論體系和療效優(yōu)勢?；罱j(luò)通腦片是一種依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論組方，利用現(xiàn)代化技術(shù)手段制成的中成藥片劑。本研究擬利用大鼠腦缺血再灌注模型來考察活絡(luò)通腦片的藥理作用，探究其對大鼠腦缺血的治療作用，為后期開發(fā)應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠[南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（粵）2016-0041，200 ～240 g]，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2016-0112。

1.2 儀器

電熱恒溫干燥箱（長沙醫(yī)療器械廠，101-4A）；AB104S 電子天平、SB32000電子天平（METTLER TOLEDO）；脫水機(jī)（TP1020）、石蠟包埋機(jī)（EG1160）、切片機(jī)（RM2155）、生物熒光顯微鏡（DM5000B）（Leica）；血小板聚集儀（上海醫(yī)大儀器廠，QX-200）；大鼠MCAO 專用栓線（北京沙東生物技術(shù)公司，2432-AAA）等。

1.3 試藥

活絡(luò)通腦片提取物干粉（未醇沉工藝樣品，HRT，批號：16070601，中山大學(xué)藥學(xué)院）；銀杏葉片（深圳海王藥業(yè)，批號：20160102）。BSA（Sigma公 司），羊 抗 兔-IgG（Abcam，ab97049），SABC（博士德公司），DAB 顯色試劑盒（Roche），血小板活化因子（PAF，SIGMA），bFGF 抗體（Abcam，ab108319），BDNF 抗體（Abcam，ab106245）等。

2 方法

2.1 造模及神經(jīng)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

參考文獻(xiàn)[4]制備大鼠缺血再灌注模型，同法制備假手術(shù)組。完成后，按照Zea Longa 的5 分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評分，0 分：無明顯神經(jīng)缺損癥狀；1 分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2 分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向?qū)?cè)傾倒；4 分：不能自行行走。

2.2 分組及給藥

將神經(jīng)評分1 ～3 分的大鼠隨機(jī)分為5 組，分別為模型對照組，HRT 低、中、高劑量組（85、170、340 mg·kg－1）和陽性對照組（銀杏葉片26 mg·kg－1），每組15 只。另設(shè)假手術(shù)組大鼠10 只。造模24 h 后開始灌胃給藥；每日給藥1 次，連續(xù)給藥14 d。藥物用蒸餾水配制成相應(yīng)的濃度，使給藥體積均為10 mL·kg－1。模型對照組和假手術(shù)組大鼠同法給予藥物溶劑蒸餾水。

2.3 神經(jīng)學(xué)評分

觀察大鼠行為學(xué)變化，參考Zea Longa 的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評分。于給藥前（造模24 h）及給藥后3、7、10、14 d 為觀察時間點(diǎn)進(jìn)行檢測。

2.4 行為學(xué)觀察

2.4.1 橫木行走實(shí)驗(yàn) 橫木行走實(shí)驗(yàn)用于評價腦缺血再灌注損傷后動物運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和整合缺損。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報道方法于給藥前（造模24 h 后）以及給藥后3、7、10、14 d 對大鼠進(jìn)行運(yùn)動功能評價。

2.4.2 前肢抓握力量測試 前肢抓握力量測試評價動物腦缺血再灌注損傷后前肢抓握力量的大小。參考文獻(xiàn)[6]方法分別于給藥前（造模24 h 后）及給藥后3、7、10、14 d 測試大鼠的前肢抓握力量。

2.5 血小板聚集實(shí)驗(yàn)

末次給藥后120 min 從腹腔靜脈抽血，以檸檬酸鈉抗凝，每管0.5 mL，用PAF（終濃度為1 nmol·L－1）誘導(dǎo)全血血小板聚集，以QX-200 全血血小板聚集儀測定聚集度（Ω），并計算血小板聚集抑制率。

2.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

于給藥14 d 后，麻醉大鼠，4%的多聚甲醛液灌注固定后斷頭取腦，除去小腦和腦干后分成三等份，取中間部分固定2 d，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，厚5 μm。分別進(jìn)行BDNF 和bFGF 免疫組化實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：常規(guī)脫水、抗原修復(fù)后，PBS 洗滌3 次，室溫封閉30 min 后分別滴加適量的含抗體BDNF（1∶100）和bFGF（1∶100）的一抗稀釋液，4℃過夜，PBS 洗滌3 次，同法滴加適量含二抗（羊抗兔1∶2000）的二抗稀釋液，37℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次×5 min 后，常規(guī)DAB 顯色后用中性樹膠封片。根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，取半暗帶和海馬相近部位同倍（400×）的6 個不同視野，用圖像分析系統(tǒng)對BDNF 和bFGF 免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞平均吸收光密度（OD值）進(jìn)行統(tǒng)計分析，取平均值。

2.7 腦部病理檢查

常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)病理學(xué)變化，并參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行評分：未觀察到組織學(xué)改變，0 分；組織學(xué)改變比例10%～20%，1 分；組織學(xué)改變比例21%～40%，2 分；組織學(xué)改變比例41%～100%，3 分。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本采用One-Way ANOVA 分析，兩組樣本采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HRT 對模型大鼠神經(jīng)學(xué)評分的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠給藥前及給藥3、7、10 和14 d 神經(jīng)功能缺損評分均有所升高（P＜0.05）。與模型對照組相比，給藥10 d和14 d，HRT 中、高劑量組以及陽性對照組均可改善神經(jīng)功能缺損評分（P＜0.05），見表1。

表1 HRT 對模型大鼠神經(jīng)學(xué)評分的影響(分，± s)Tab 1 Effect of HRT on the neurological score in rats (score，± s)

表1 HRT 對模型大鼠神經(jīng)學(xué)評分的影響(分，± s)Tab 1 Effect of HRT on the neurological score in rats (score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d 存活率/n（%）假手術(shù)組 0.05±0.11 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 10（100）模型對照組 1.62±0.48a 1.58±0.70a 1.38±0.62a 1.23±0.52a 1.18±0.46a 11（73）HRT 低劑量組 1.64±0.53 1.33±0.49 0.14±0.50 1.05±0.50 1.02±0.50 11（73）HRT 中劑量組 1.62±0.52 1.35±0.47 1.17±0.33 0.83±0.25b 0.79±0.26b 11（73）HRT 高劑量組 1.59±0.51 1.27±0.47 0.98±0.39 0.81±0.25b 0.77±0.26b 13（87）陽性對照組 1.62±0.47 1.35±0.43 1.24±0.40 0.83±0.33b 0.79±0.33b 12（80）

3.2 HRT 對模型大鼠橫木行走能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠給藥前以及給藥3、7、10 和14 d 平衡木行走評分均有下降（P＜0.05）。與模型對照組比較，HRT 中、高劑量組和陽性對照組大鼠給藥后7、10 和14 d 橫木行走能力均有所改善（P＜0.05），見表2。

3.3 HRT 對模型大鼠前肢抓握力的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠給藥前以及給藥3、7、10 和14 d 前肢抓握力均明顯降低（P＜0.05）。與模型對照組比較，HRT 高劑量組大鼠給藥后7 ～14 d 前肢抓握力有顯著改善（P＜0.05），見表3。

3.4 HRT 對模型大鼠血小板聚集的影響

與模型對照組比較，HRT 各劑量組及陽性對照組均能明顯抑制PAF 誘導(dǎo)的體外血小板聚集（P＜0.05），見表4。

3.5 HRT 對模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組海馬及半暗帶中bFGF 和BDNF 的表達(dá)改變不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型對照組相比，HRT高劑量組海馬bFGF 表達(dá)量增加（P＜0.05），HRT中、高劑量組和陽性對照組海馬BDNF 表達(dá)量增加（P＜0.05）；HRT 中、高劑量組和陽性對照組半暗帶bFGF 表達(dá)量增加（P＜0.05），HRT 中、高劑量組半暗帶BDNF 表達(dá)增加（P＜0.05），見表5。

表2 HRT 對模型大鼠橫木行走能力的影響(分，± s)Tab 2 Effect of HRT on the beam-walking performance in rats (score，± s)

表2 HRT 對模型大鼠橫木行走能力的影響(分，± s)Tab 2 Effect of HRT on the beam-walking performance in rats (score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d假手術(shù)組 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0模型對照組 1.3±0.5 1.5±0.7a 1.9±0.6a 2.5±0.8a 2.8±0.6a HRT 低劑量組 1.4±0.5 1.8±0.4 2.6±0.7 3.3±0.6 4.2±0.8 HRT 中劑量組 1.3±0.4 1.9±0.8 2.8±0.9b 3.6±1.2b 4.6±1.2b HRT 高劑量組 1.3±0.7 1.9±0.8 2.9±0.8b 3.9±0.8b 5.1±1.0b陽性對照組 1.4±0.5 1.9±0.7 3.1±0.7b 3.8±1.0b 5.1±1.3b

表3 HRT 對模型大鼠前肢抓握力的影響(g，± s)Tab 3 Effect of HRT on the bar-grasping performance in rats (± s)

表3 HRT 對模型大鼠前肢抓握力的影響(g，± s)Tab 3 Effect of HRT on the bar-grasping performance in rats (± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥1 d 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d假手術(shù)組 764±100 873±98 969±94 1049±100 1086±97模型對照組 592±79a 634±99a 672±101a 679±125a 695±118a HRT 低劑量組 592±95 606±95 656±95 707±110 726±108 HRT 中劑量組 592±97 606±101 737±108 758±102 778±111 HRT 高劑量組 597±101 623±114 765±124b 790±114b 861±143b陽性對照組 595±87 610±101 722±107 785±118 850±145b

表4 HRT 對模型大鼠血小板聚集的影響(± s)Tab 4 Effect of HRT on the platelet aggregation in rats (± s)

表4 HRT 對模型大鼠血小板聚集的影響(± s)Tab 4 Effect of HRT on the platelet aggregation in rats (± s)

注：與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 血小板聚集率/Ω 聚集抑制率/%假手術(shù)組 10.33±1.42 11.55模型對照組 11.68±1.42 0.00 HRT 低劑量組 9.23±1.79b 20.99 HRT 中劑量組 9.08±0.93b 22.19 HRT 高劑量組 9.36±1.26b 19.87陽性對照組 9.29±1.61b 20.47

3.6 HRT 對模型大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腦皮質(zhì)和海馬均明顯損傷，表現(xiàn)為腦皮質(zhì)體細(xì)胞大面積變性壞死，出現(xiàn)明顯梗死灶，炎性細(xì)胞浸潤明顯等現(xiàn)象。與模型對照組比較，各給藥組均有一定的改善作用，表現(xiàn)為腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死減輕，梗死灶相對較小，炎性細(xì)胞浸潤減輕，其中HRT 中、高劑量組和陽性對照組大腦皮質(zhì)損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HRT 高劑量組海馬損傷評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6及圖1。

表5 HRT 對模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響(± s)Tab 5 Effect of HRT on the BDNF and the bFGF expression at hippocampus and penumbra areas in rats (± s)

表5 HRT 對模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響(± s)Tab 5 Effect of HRT on the BDNF and the bFGF expression at hippocampus and penumbra areas in rats (± s)

注：與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 海馬bFGF 海馬BDNF 半暗帶bFGF 半暗帶BDNF假手術(shù)組 0.38±0.02 0.31±0.06 0.36±0.03 0.32±0.02模型對照組 0.37±0.04 0.33±0.03 0.35±0.03 0.32±0.05 HRT 低劑量組 0.39±0.06 0.35±0.06 0.38±0.05 0.34±0.03 HRT 中劑量組 0.42±0.08 0.36±0.04b 0.40±0.03b 0.36±0.03b HRT 高劑量組 0.43±0.08b 0.40±0.05b 0.44±0.04b 0.39±0.05b陽性對照組 0.42±0.07 0.37±0.05b 0.41±0.05b 0.36±0.05

4 討論

近年來，腦血管病逐年上升，已經(jīng)給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅，成為僅次于心肌梗死的第二大致死性疾病[8]。腦卒中是一種發(fā)病率很高的腦血管疾病，已經(jīng)成為影響傷殘調(diào)整壽命年第三大因素[9]。在國內(nèi)，腦卒中每年新增病例超過200 萬[10-11]。研究顯示，缺血性腦卒中整個發(fā)病過程中，除了缺血對腦組織造成損傷外，缺血區(qū)組織恢復(fù)血流灌注后會加重?fù)p傷，出現(xiàn)“二次”損傷，即腦缺血再灌注損傷[12]。腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制較為復(fù)雜，影響因素也比較多，不同疾病階段的因素也有所不同。因此，研發(fā)治療缺血性腦卒中的藥物也需考慮到多方面的因素，尋找相應(yīng)的策略和作用靶點(diǎn)。

表6 HRT 對模型大鼠腦組織病理改變的影響(分，± s)Tab 6 Effect of HRT on the cerebral pathological changes in rats(score，± s)

表6 HRT 對模型大鼠腦組織病理改變的影響(分，± s)Tab 6 Effect of HRT on the cerebral pathological changes in rats(score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 大腦皮質(zhì)損傷評分 海馬損傷評分假手術(shù)組 1.20±0.42 1.10±0.57模型對照組 7.45±2.07a 3.00±1.26a HRT 低劑量組 6.73±3.26 2.18±0.75 HRT 中劑量組 5.18±2.79b 2.09±0.70 HRT 高劑量組 5.46±2.47b 1.69±1.10b陽性對照組 5.25±2.67b 2.08±1.68

腦缺血最主要的后遺癥就是神經(jīng)功能障礙和運(yùn)動功能障礙[13]，本研究重點(diǎn)評價了模型動物的神經(jīng)功能和運(yùn)動功能，結(jié)果顯示，HRT 能夠顯著改善動物的神經(jīng)學(xué)評分和運(yùn)動功能評分，提高模型動物的橫木行走能力及前肢抓握力，表明HRT可以改善腦缺血動物的神經(jīng)功能和運(yùn)動功能。

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)（上）及海馬CA3 區(qū)（下）HE 染色（100×）Fig 1 Hematoxylin eosin staining of the cerebral cortex area（up）and the hippocampal CA3 area（down）in rats（100×）

腦血管血液循環(huán)正常離不開血液因素和血管因素，當(dāng)血液循環(huán)發(fā)生障礙時，腦組織供氧供血量不足，繼而發(fā)生缺血性腦卒中[14]，改善血管血液功能、恢復(fù)大腦血液供應(yīng)是治療缺血性腦卒中的重要手段[15]，治療藥物包括靜脈溶栓藥、抑制血小板藥物和中藥復(fù)方等[16]。本研究中，HRT能夠明顯抑制PAF 誘導(dǎo)的體外血小板聚集，提示HRT 具有抑制血小板聚集，減少血栓形成，進(jìn)而改善血液循環(huán)的作用。

BDNF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，在神經(jīng)元的生長分化過程中作用至關(guān)重要，是維持神經(jīng)元正常生理功能必不可少的內(nèi)源性物質(zhì)之一[17]。bFGF 具有多種生物學(xué)活性，含有154 個氨基酸。正常生理狀態(tài)下，腦內(nèi)bFGF 表達(dá)量較少；在缺血性腦卒中發(fā)生后，bFGF 表達(dá)量增加，其受體表達(dá)隨之上調(diào)，bFGF 能減少缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，對受損神經(jīng)細(xì)胞有重要的保護(hù)作用[18]。本研究中，HRT 能夠顯著提高模型大鼠腦組織bFGF 和BDNF 的含量，提示HRT 具有提高bFGF 和BDNF 表達(dá)的作用，這一作用可能與其改善大鼠腦缺血再灌注有關(guān)。

腦組織結(jié)構(gòu)的完整性是正常生理功能的前提條件，海馬和皮質(zhì)結(jié)構(gòu)在腦組織的作用至關(guān)重要，一旦腦缺血發(fā)生，就會直接導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)的損傷。本研究中，HE 染色的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，還顯示HRT 能夠顯著改善模型大鼠缺血再灌注造成的腦組織損傷。

綜上，HRT 具有較好地治療大鼠腦缺血再灌注損傷的作用，本研究可為HRT 后期開發(fā)應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。